RNAi對凋亡抑制蛋白FLIP在肝癌組織中表達的影響及意義.pdf

1、肝細胞肝癌（HCC）是一種惡性度極高的常見腫瘤，通常發(fā)現(xiàn)較晚而病情發(fā)展迅速，其發(fā)生、發(fā)展均不是十分清楚。肝癌細胞發(fā)生凋亡，即程序性死亡，是一種由基因調(diào)控的自主性自身破壞過程，可使細胞形態(tài)發(fā)生改變、DNA斷裂和蛋白發(fā)生交聯(lián)。凋亡細胞數(shù)量減少是腫瘤產(chǎn)生的根本原因之一。 細胞增殖與凋亡失衡是腫瘤形成和發(fā)展的一個重要機制，該過程涉及多個基因的改變，并受著復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apopt

2、osis protein, IAP）家族是一類重要的抗細胞凋亡因子，該家族結(jié)構(gòu)的共同特點是N端含有一個或多個串聯(lián)的桿狀病毒IAP重復(fù)序列（baculovirus IAP repeat, BIR），C端含或不含有一個環(huán)指（RING finger）結(jié)構(gòu)。FLIP是新近發(fā)現(xiàn)的IAP家族中的一個重要成員，近年來的研究表明FLIP具有強大的抗細胞凋亡作用，并在維持細胞有絲分裂以及血管形成過程中扮演重要角色。 FLIP（即FLICE in

3、hibitory protein，也稱為CASH，Casper FLIP，CLARP，F(xiàn)LAMME MRI）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類含有死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（death efectdomains, DED）的凋亡抑制蛋白，在病毒、真核生物、哺乳動物等許多物種中廣泛存在。已證實FLIP與炎癥、腫瘤、自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，在人類多種常見腫瘤中存在高表達，提示FLIP與多種人類腫瘤的形成和發(fā)展有著密切關(guān)系。 腫瘤細胞凋亡的減少與腫瘤的

4、發(fā)生、發(fā)展的密切相關(guān)。并且使細胞耐受放療、化療的刺激。因而，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡成為了一種新的殺傷腫瘤細胞的治療策略。FLIP定位于2q33-34，是一個凋亡抑制基因，屬于IAP家族。FLIP具有抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)細胞分裂的雙重功能。它抑制凋亡的作用是通過與凋亡效應(yīng)分子caspase-8直接結(jié)合實現(xiàn)的。而腫瘤細胞內(nèi)高表達FLIP使其不受Fas／FasL介導(dǎo)的凋亡作用并逃避免疫監(jiān)視是腫瘤增殖、惡化的重要原因。所以可以抑制Fas、Bax、cas

5、pase分子和抗腫瘤藥物引起的凋亡。FLIP是一個天然存在的caspase-8抑制蛋白，它缺乏催化活性所必需的關(guān)鍵的半胱氨酸結(jié)構(gòu)，是Fas介導(dǎo)的細胞凋亡的負調(diào)節(jié)蛋白，降低FLIP的水平可以致敏腫瘤細胞對Fas和TRAIL介導(dǎo)的細胞凋亡。然而，調(diào)節(jié)FLIP表達的分子機制還未完全明確．因此對FLIP分子調(diào)節(jié)機制的研究將有助于進一步了解與FLIP相關(guān)疾病的發(fā)生機制，并對臨床治療這些疾病提供一個新的思路。 RNA干涉（RNA inter

6、ference，RNAi）是一種廣泛存在于高等植物和動物中的由雙鏈RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉寂（PTGS）現(xiàn)象。外源的雙鏈RNA（dsRNA）在細胞內(nèi)一種被稱為Dicer的核酸酶的作用下，首先被剪切成含19-23個核苷酸對的小RNA片段，稱為小干涉RNA（small interfering RNA，siRNA）。后者與Dicer和其他一些蛋白質(zhì)共同構(gòu)成RNA誘導(dǎo)的沉寂復(fù)合物（RISC），依靠堿基互補規(guī)律識別與siRNA同源的mRNA分子，

7、并將它們降解。目前RNAi作為一種高效特異地抑制基因表達的新技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于基因功能和基因治療等研究中。在腫瘤基因治療中，通過人工合成特定癌基因靶向的siRNA，或構(gòu)建上述siRNA的表達載體，并將它們導(dǎo)入腫瘤細胞中，可以特異性地抑制目的基因的表達。 本實驗是利用免疫組化和RNAi技術(shù)研究FLIP在肝臟組織及肝癌組織表達和意義。 研究目的： 研究FLIP在肝臟組織及肝癌組織不同分級中的表達，并觀察人肝癌細胞H

8、epg2和SMMC-7721細胞系中siRNA對FLIP表達的抑制作用和與凋亡的關(guān)系。 研究方法： 1. 免疫組織化學法檢測FLIP表達分析46例肝癌標本，27例肝硬化組織標本，18例肝臟血管瘤標本，12例正常肝組織標本，10個肝癌Hepg2細胞系細胞爬片標本中LFIP蛋白的表達。 應(yīng)用FLIIP的抗體對上述患者的組織切片進行免疫組織化學染色并進行統(tǒng)計學分析。 2. FLIP表達與肝癌組織分級的關(guān)系分析

9、86例肝癌標本（采用經(jīng)典的Edmondson四級分級法，I級18例，II級25例，III級21例，IV級22例），肝癌Hepg2和7721細胞系2株細胞爬片的10個樣本中FLIP蛋白的表達并進行統(tǒng)計學分析比較。 3. RNAi載體的構(gòu)建及鑒定根據(jù)Flip mRNA 序列，選取針對Flip mRNA526～544，1164～1182，1305～1323 處序列的3 個RNA 干擾靶位點，設(shè)計并合成寡核苷酸序列，將合成的單鏈寡核苷

10、酸溶解退火成雙鏈DNA。pSUPER 載體用Bgl II，Hind III酶切后與上述雙鏈DNA 連接，16℃孵育過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，篩選陽性菌落提取質(zhì)粒酶切鑒定并測序正常。 4. 重組載體干擾效率分析人肝癌細胞7721、Hepg2 與宮頸癌細胞Hela在含10g/L小牛血清的1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的7721、Hepg2 與Hela細胞，2.5g/L胰酶消化后，按一定的密度接種于6 孔培養(yǎng)板中，

11、次日應(yīng)用Invitrogen 公司的Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染。24h后傳代，加入濃度為400μg/mlG418 篩選，四周后挑取多個單集落擴大培養(yǎng)。 對各組細胞進行HE染色、透射電鏡等形態(tài)學觀察。應(yīng)用RT-PCR、間接免疫熒光法、TUNEL法檢測細胞凋亡、western－blot分別檢測FLIP的mRNA和蛋白的水平變化與凋亡的關(guān)系。 分別取2×106個轉(zhuǎn)染pSUPER-S1的人肝癌細胞772

12、1、Hepg2細胞和陰性對照細胞分別接種于裸鼠（各6只）皮下，進行裸鼠體內(nèi)成瘤實驗。 研究結(jié)果： 1. 肝臟組織FLIP 的表達凋亡抑制蛋白FLIP 在46 例肝癌標本中有39 例陽性表達（84.73％），在10 例肝癌Hepg2 細胞系細胞爬片標本全部陽性表達（100％），27 例肝硬化標本中4 例陽性表達(14.81％)，30 例肝血管瘤和正常肝組織中2 例陽性表達（6.67％），其余均為陰性（P<0.01）。

13、 2. 不同肝癌組織分級FLIP 表達差異凋亡抑制蛋白FLIP 在86 例肝癌標本中有72 例陽性表達（83.72％），I級13/18（72.22％），II 級20/25（80.00％），III 級18/21（85.71％），IV 級21/22（95.45％）（P﹤0.05）；在肝癌Hepg2、7721 細胞系細胞爬片10 個樣本中全部陽性表達（100％），（P<0.01）。 3. pSUPER重組質(zhì)粒酶切鑒定重組質(zhì)粒用B

14、glⅡ和Hind Ⅲ雙酶切，陽性質(zhì)粒應(yīng)該能夠切下一長度大約為60bp 的片斷。而對照組空質(zhì)粒（對照是針對來源于深海水母增強綠色熒光蛋白( EGFP)的一段序列，與人無同源性，作為無關(guān)序列對照）由于BglⅡ和Hind Ⅲ兩個酶切位點相鄰，不能切出片斷。酶切后用2％的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示三對siRNA 的寡核苷酸重組表達載體均有陽性克隆。DNA 測序結(jié)果也證實重組質(zhì)粒中已插入目的片段。陽性質(zhì)粒分別命名為pSUPER-S1、pSUPER-

15、S2、pSUPER-S3。 4. RT-PCR和Western－blot對干涉表達載體效率的鑒定在mRNA 及蛋白水平上，三個重組載體均有不同程度的干涉效果，尤其以pSUPER-S1 最為明顯，效率至少在70％以上。通過免疫組化、凋亡等功能研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pSUPER-S1 的人肝癌細胞SMMC-7721、Hepg2 組部分細胞變得較大而扁平，并失去短梭形的特點，其它細胞形態(tài)上未見明顯變化。 TUNEL法檢測細胞凋亡顯

16、示，轉(zhuǎn)染pSUPER-S1 組細胞凋亡率較對照組增加5 倍；在熒光顯微鏡下，轉(zhuǎn)染pSUPER-S1 組部分細胞核致密濃染或碎塊狀濃染，凋亡率達47.3％；透射電鏡顯示轉(zhuǎn)染pSUPER-S1 組中部分細胞存在典型的凋亡形態(tài)，而對照組凋亡細胞較少。 5. 裸鼠體內(nèi)成瘤實驗14天后對照組6只全部成瘤。4周后，對照組平均瘤體積為740mm，而轉(zhuǎn)染pSUPER-S1組僅有2只有可在皮下觸及很小的瘤體，直徑約為1.3mm，其余4只未見腫瘤

17、生長。轉(zhuǎn)染pSUPER-S1的人肝癌細胞SMMC-7721、Hepg2細胞組體內(nèi)成瘤能力顯著下降。 結(jié)論： 1. 凋亡抑制蛋白FLIP在肝癌組織中陽性表達明顯，在良性肝組織中陽性表達不明顯。 2. 凋亡抑制蛋白FLIP在肝癌組織中呈陽性表達；不同分化的肝癌組織其表達陽性率不同，分化越差起陽性表達率越高。 3.應(yīng)用RNA干涉載體，可以在細胞內(nèi)形成特異性siRNA抑制FLIP的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制細