Epha4在胃癌組織中表達(dá)及意義.pdf

1、目的：和背景:
　　 胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,據(jù)報(bào)道全世界在2002年新診斷惡性腫瘤病例為10900000,因癌癥死亡病例數(shù)為6700000?，F(xiàn)患癌癥患者24600000.其中胃癌新發(fā)病數(shù)為934000,其排位由原來的第二位降到了第四位(乳腺癌躍居第二位),而死亡病例數(shù)為700000,仍僅次于肺癌占第二位。胃癌的流行病學(xué)有明顯的地理差別,日本、中國智利遠(yuǎn)東歐洲和俄羅斯為高發(fā)地區(qū),而美國澳大利亞丹麥新西蘭發(fā)病最低,2/3

2、的胃癌患者在發(fā)展中國家,其中中國占42％胃癌是我國的最常見惡性腫瘤之一據(jù)1990-1992年我國1/10人口惡性腫瘤死因抽樣發(fā)現(xiàn),胃癌死亡率占第一位(粗死亡率為25.2/10萬)。西北地區(qū)和東南沿海地區(qū)發(fā)病率較高,廣西廣東貴州發(fā)病率低,近30年來,我國城市居民胃癌發(fā)病率在男女性中都呈下降趨勢,但衛(wèi)生部信息統(tǒng)計(jì)中心2001年的資料顯示,全國城市居民惡性腫瘤死因順序中胃癌仍占第三位。胃癌仍是嚴(yán)重威脅人民健康的疾病1。盡管在一些研究中心發(fā)現(xiàn),

3、近年來胃癌預(yù)后有所改善,但以人群為基礎(chǔ)的胃癌總體生存率仍未見明顯提高。研究明,腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌病人預(yù)后不良的主要因?yàn)?如何預(yù)防和治療胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是當(dāng)今胃癌研究的重點(diǎn)之一。Epha4屬于酪氨酸蛋白激酶受體(ireceptortyrosinekinases,RTKs)家族中的較大分支Eph亞族。廣泛參與細(xì)胞生長、分化、遷延、作為Eph家族一員,Epha4廣泛表達(dá)于正常的各組織器官中,并在人體多種腫瘤組織中高表達(dá)。近期研究發(fā)現(xiàn),E

4、pha4可促進(jìn)一些腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。因Epha4在人體胃癌中表達(dá)的少有研究,其在胃癌中的表達(dá)與腫瘤臨床病理特征之間的關(guān)系報(bào)道較少報(bào)道。探索Epha4在胃癌中的表達(dá),有助于進(jìn)一步了解胃癌惡性發(fā)展機(jī)制,為胃癌分子的靶向治療提供依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 1.組織標(biāo)本以及患者病理資料的搜集,病理載玻片的制備
　　 隨機(jī)選取鄭州大學(xué)一附院2008年5月～12月共66例胃癌根治手術(shù)切除標(biāo)本,相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本40例,癌旁

5、組織距瘤緣3～5ern經(jīng)過病理證實(shí)均無癌成份,另外收集距瘤緣5～10em經(jīng)病相應(yīng)病理學(xué)證實(shí)確認(rèn)為正常組織標(biāo)本14例,所有標(biāo)本組織手術(shù)切下后一部分放入凍存管中,并迅速移至-80℃冰箱凍存,另一部分立即放10％中性福爾馬林溶液內(nèi)固定,石蠟包埋,切片機(jī)切割病理組織以4μm平均厚度制備組織切片,所有患者均經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)確診為胃癌,術(shù)前均未接受化療和放療,其中男性34例(63.0％),女性32例(37.0％),年齡26～80歲,平均58歲,患者

6、年齡,性別,腫塊大小,病理分期統(tǒng)計(jì)完成,腫瘤的臨床病理分期依據(jù)2002年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)所定的胃癌分期法。
　　 2.標(biāo)本中epha4mRNA表達(dá)水平的測定。
　　 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RX-PCR)方法,在液氮速凍條件下把2對(duì)組織標(biāo)本磨成粉末,以Trizol試劑提取組織總RNA,行常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄PCR。所用引物根據(jù)采用PRIMER3軟件設(shè)計(jì)EphA4144bp上游F:5’-GGGCGTCTCAAAGTGC-3’

7、下游R:5’-GTGAATGATGTTCGGATG-3’內(nèi)參GAPDH:379bp上游F:5’-CCCATCACCATCTTCCAGG-3’下游R:5’-CATCACGCCACAGTTTCC-3’PCR程序:95℃預(yù)變性4min；94℃變性30s,54℃退火30s,72℃延伸30s；共29個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸8min.2％瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增產(chǎn)物置于2％的瓊脂糖凝膠(0.5pg/ml澳化乙錠染色)上,80v電約30mni,紫外反射投射儀

8、下觀察條帶,凝膠圖像分析儀對(duì)目的基因(Epha4)及內(nèi)參照基因(GADPH)進(jìn)行積分吸光度分析并攝像,對(duì)比DNAmakrer,擴(kuò)增出144bp條帶為陽性表達(dá),內(nèi)參照基因?yàn)?79bp條帶。Epha4/GADPH灰度比值代表目的基因Epha4mRNA在各樣本中的表達(dá)水平。
　　 3.標(biāo)本中epha4蛋白水平的測定
　　 免疫組化染色采用免疫組化SP法,石蠟標(biāo)本行4μm厚連續(xù)切片,具體染色方法按試劑盒說明書進(jìn)行。Epha4染色

9、結(jié)果判定以腫瘤細(xì)胞陽性百分比及染色強(qiáng)度進(jìn)行腫瘤細(xì)胞陽性計(jì)分,陽性結(jié)果判定:首先在高倍鏡下計(jì)數(shù)1000個(gè)腫瘤細(xì)胞,避開腫瘤邊緣及壞死區(qū)域,根據(jù)陽性瘤細(xì)胞數(shù)目所占百分比得出Epha4標(biāo)記指數(shù)(L1)。L1=陽性瘤細(xì)胞/1000個(gè)瘤細(xì)胞×100％。分為以下4級(jí)記分:陰性0分,<10％；Ⅰ級(jí)1分,10％～25％；Ⅱ級(jí)2分,25％～50％；Ⅲ級(jí)3分,50％以上。按瘤細(xì)胞著色的深淺計(jì)分染色強(qiáng)度:1分,弱；2分,中等；3分,強(qiáng)。2個(gè)分值相加即為該標(biāo)本

10、的免疫組化陽性計(jì)分:0～1分為陰性,記為(-)；1～4分為弱陽性,記為(+)；5分以上為陽性,記為(++)。其中,(-)和(+)為低表達(dá)組,(++)為高表達(dá)組。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 所有數(shù)據(jù)均由SPSS1110 for windows統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。Epha4蛋白表達(dá)與臨床各病理因素之間的顯著性以及兩者表達(dá)的相關(guān)性采用x檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05,mRNA在不同組織中的表達(dá)采用方差分析及兩兩比較的方法。

11、　　 結(jié)果：
　　 1.Epha4mRNA的表達(dá)特征為分析Epha4mRNA在胃癌和癌旁組織中表達(dá)情況,對(duì)配對(duì)胃癌組織標(biāo)本進(jìn)行RT-PCR熒光檢測比較。結(jié)果顯示,腫瘤組織中Epha4基因mRNA表達(dá)明顯高于癌旁正常組織和正常組織其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。癌旁組織及正常胃組織之間無明顯差異(p>0.05)
　　 2.免疫組化分析Epha4蛋白在胃癌組織中的表達(dá)免疫組化染色顯示:66例胃癌患者的石蠟切片標(biāo)本中,

12、Epha4蛋白陽性率為53.0％(35/66),陽性表達(dá)主要集中在癌細(xì)胞胞漿中,表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒,也有少量為胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色,而對(duì)照組癌旁組織中Epha4陽性率27.5％(11/40)正常組織中Epha4陽性率14.3％(2/141。
　　 3.Epha4胃癌的各臨床病理因素與表達(dá)的關(guān)系如表2所示,Epha4的表達(dá)與腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān),其陽性表達(dá)率分別為36.67％、66.6

13、7％(p<0.05)28.57％、71.05％(p<0.01)27.78％、62.50％(p<0.05)；38.64％、81.81％(p<0.01)即隨著腫瘤分化程度降低Epha4陽性表達(dá)率也增高；隨著癌組織臨床分期的增加,Epha4在癌細(xì)胞內(nèi)的含量逐漸增高；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Epha4陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者Epha4的陽性表達(dá)率明顯高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。而Epha4與患者性別、年齡、腫瘤的大小、浸潤深度(p>0.05)無

14、關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.EphA4在胃癌組織中呈高表達(dá),其高表達(dá)與胃癌的分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān),而與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤的大小、癌組織浸潤深度(p>0.05)無關(guān)。
　　 2.腫瘤組織中Epha4基因mRNA表達(dá)明顯高于癌旁正常組織和正常組織其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。Epha4 mRNA在癌旁組織及正常胃組織之間無明顯差異(p>0.05)。
　　 3.Ep