Intelectin-1在哮喘患者急性發(fā)作期血漿中的表達(dá)水平及intelectin-1在CD4+T淋巴細(xì)胞分化中的作用.pdf

1、研究背景:
　　 支氣管哮喘是由多種細(xì)胞（肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞）和細(xì)胞因子參與的氣道慢性炎癥。據(jù)西方學(xué)者統(tǒng)計(jì)研究發(fā)現(xiàn)哮喘的發(fā)病率正逐年提高，在青年人中的發(fā)病比例為5-6％，而在兒童中不僅發(fā)病率升高，而且容易發(fā)生致死性哮喘。研究表明在哮喘的不同階段有不同的細(xì)胞因子在發(fā)揮各自的特異性作用。
　　 Intelectin 隸屬于凝集素家族，可分為intelectin-1和intelectin-2。最早在小鼠小腸潘式

2、細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的intelectin-1。隨后在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)intelectin(hIntL),人的intelectin 蛋白是一種分泌型糖蛋白，包含295個(gè)氨基酸.和一個(gè)N 端低聚糖，它的分子量是120KD，基本結(jié)構(gòu)是三聚體。hIntL mRNA在人的心臟，小腸，結(jié)腸等組織內(nèi)均有表達(dá)，與鼠的intelectin 相比兩者具有高度同源性。我們?cè)谥暗难芯恐邪l(fā)現(xiàn)：在卵清蛋白致敏的小鼠哮喘模型中，Realtime-PCR法檢測(cè)，小鼠肺組織內(nèi)的in

3、telectin mRNA 轉(zhuǎn)錄水平增加，免疫組化證實(shí)小鼠氣道內(nèi)粘液蛋白比正常組增加。另有文獻(xiàn)報(bào)道在結(jié)腸粘液腺癌患者中，IL-4、IL-13 可引起hIntL-1表達(dá)上調(diào)。Omentin(網(wǎng)膜素)是最近被證實(shí)的一種高度選擇性分泌型蛋白，在內(nèi)臟脂肪和皮下脂肪組織內(nèi)表達(dá)。Omentin 又分為omentin-1,omentin-2,兩者之間有83％的氨基酸相同，具有高度同源性。Omentin在其它組織內(nèi)也有低水平的表達(dá)，同時(shí)它又被認(rèn)為是in

4、telectin。
　　 對(duì)環(huán)境中的過敏原產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)是常見的健康問題，目前哮喘的發(fā)病機(jī)制仍然不是很清楚。CD4+T 淋巴細(xì)胞參與慢性過敏性疾病，Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、TNF-α等,Th2細(xì)胞主要分泌IL-4,IL-5,IL-13等細(xì)胞因子調(diào)節(jié)過敏反應(yīng)。CC 趨化因子和Th-2細(xì)胞因子在哮喘和其它免疫疾病中起著關(guān)鍵作用。在Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子中IL-4和IL-13在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。哮喘患者的肺組織和其它變

5、態(tài)反應(yīng)部位組織中這些細(xì)胞因子表達(dá)增加。因?yàn)镮L-13 可以加劇嗜酸性粒細(xì)胞的炎癥和粘液分泌，所以它被認(rèn)為是哮喘的關(guān)鍵因子之一。
　　 T細(xì)胞的分化方向由固有免疫系統(tǒng)及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子決定。CD4+T 淋巴細(xì)胞最終分化成Th1和Th2細(xì)胞，通過對(duì)IL-2，IL-4，IL-5,IL-13,GM-CSF,IFN-γ之間內(nèi)在關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)：CD4+T的分化方向由這些因子轉(zhuǎn)錄水平的高低決定。細(xì)胞因子通過有絲分裂嚴(yán)格控制T細(xì)胞的分化，通過研

6、究這些基因在分裂中的表達(dá)，我們已經(jīng)能夠確定增值和分化的關(guān)系，IL-2的初期表達(dá)和細(xì)胞周期無關(guān)，而效應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)與細(xì)胞周期有關(guān)，IFN-γ的表達(dá)需要細(xì)胞不停地進(jìn)行分裂，IL-4的表達(dá)需要三次細(xì)胞分裂，而且細(xì)胞周期和細(xì)胞因子信號(hào)必須一致行動(dòng)。氣道上皮細(xì)胞暴露于抗原時(shí)，往往不能優(yōu)先激活Th2細(xì)胞，曾有人報(bào)道過Th1 介導(dǎo)抗原促進(jìn)Th2細(xì)胞反應(yīng)。哮喘的發(fā)病機(jī)制說明T細(xì)胞因子參與其中，包括IL-4 及其受體。選擇性中和IL-13 受體可減輕哮

7、喘炎癥的進(jìn)展。在寄生蟲感染的IL-4 突變（IL-4-/-）小鼠模型中,發(fā)現(xiàn)Th2細(xì)胞效應(yīng)不能啟動(dòng)，Th2細(xì)胞因子IL-5、IL-9以及CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-10表達(dá)下降，推測(cè)Th2細(xì)胞分泌細(xì)胞因子需要IL-4的誘導(dǎo)。
　　 之前在小鼠哮喘模型中研究發(fā)現(xiàn)：小鼠的肺組織中intelectin-1,intelectin-2的mRNA表達(dá)水平增加，小鼠氣道內(nèi)的粘液蛋白分泌增加，小鼠的肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量及其比例增加

8、。為了檢測(cè)intelectin-1在哮喘患者急性發(fā)作期血漿中的表達(dá)水平，收集哮喘患者和正常健康志愿者血漿，觀察intelectin-1在兩組血漿中的蛋白水平，并檢測(cè)IL-13的水平和肺功能,探討intelectin和IL-13、肺功能之間的相關(guān)性。進(jìn)一步探討intelectin-1是否參與CD4+T 淋巴細(xì)胞的分化。目的在于進(jìn)一步了解intelectin-1在哮喘發(fā)病中的作用機(jī)理，并闡明哮喘的發(fā)病機(jī)制，為哮喘的治療提供新思路，本實(shí)驗(yàn)擬分

9、為兩部分：
　　 第一部分 Intelectin-1在哮喘患者急性發(fā)作期血漿中的表達(dá)水平
　　 目的：檢測(cè)哮喘患者血漿中intelectin-1是否升高及其與肺功能的相關(guān)性。
　　 方法：
　　 1、收集外周血血漿為研究標(biāo)本，將樣本分為哮喘組（n=16）和正常組（n=19）。
　　 2、測(cè)定每例納入對(duì)象的肺功能。
　　 3、ELISA 法測(cè)定兩組血漿中的intelectin-1 水平。

10、r>　　 4、ELISA 法測(cè)定兩組血漿中的IL-13的水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、與正常組相比較哮喘患者的FEV1/FVC％，F(xiàn)EV1/預(yù)計(jì)值均顯著降低降低（p<0.05）。
　　 2、與正常組相比較哮喘患者血漿中intelectin-1 含量顯著升高（p<0.05）。
　　 3、與正常組相比較哮喘患者血漿中IL-13 含量顯著升高（p<0.01）。
　　 結(jié)論：哮喘患者血漿中intele

11、ctin-1 水平升高，intelectin-1 水平和肺功能之間沒有相關(guān)性。哮喘患者的FEV1/FVC％，F(xiàn)EV1/預(yù)計(jì)值降低。
　　 第二部分 Intelectin-1在CD4+T 淋巴細(xì)胞分化中的作用
　　 目的：探討intelectin-1在小鼠CD4+T 淋巴細(xì)胞分化中的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、制備條件培養(yǎng)基。
　　 2、無菌分離小鼠脾臟，應(yīng)用磁珠分選出T細(xì)胞，分為對(duì)照組和i

12、tln組。
　　 3、提取RNA，用Real time-PCR法檢測(cè)Th2細(xì)胞因子（IL-4、IL-5、IL-13）和Th-1細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α）的mRNA 水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、與對(duì)照組淋巴細(xì)胞相比，用含有intelectin-1 蛋白的條件培養(yǎng)基孵育的CD4+T淋巴細(xì)胞內(nèi)IL-5mRNA 轉(zhuǎn)率水平顯著升高（n=3,p<0.05）。
　　 2、與對(duì)照組淋巴細(xì)胞相比，含有intel