Intelectin在吸煙所致肺部炎癥中的作用.pdf

1、第一部分香煙提取物對(duì)小鼠肺上皮細(xì)胞intelectin及白介素6、單核細(xì)胞趨化因子1表達(dá)的影響
　　目的：檢測(cè)香煙提取物刺激小鼠肺上皮細(xì)胞后，intelectin、IL-6和MCP-1的表達(dá)，為下一步的研究提供方向。
　　 方法：我們選擇小鼠肺上皮細(xì)胞MLE-12作為研究細(xì)胞，首先檢測(cè)香煙提取物（CSE）對(duì)該細(xì)胞的毒性以選擇合適的刺激濃度和刺激持續(xù)時(shí)間，隨后用定量PCR方法檢測(cè)不同濃度CSE以及同一濃度不同時(shí)間點(diǎn)刺激小鼠

2、肺上皮細(xì)胞后，intelectin、IL-6和MCP-1的表達(dá)。
　　 結(jié)果：用濃度>10％的CSE刺激細(xì)胞24h后，細(xì)胞活性顯著降低，而延長(zhǎng)刺激時(shí)間至72h時(shí)，CSE濃度大于2.5％后其活性就有較明顯的下降。因此，我們選用5％CSE、10％CSE刺激小鼠肺上皮細(xì)胞24h，結(jié)果與預(yù)期的恰恰相反，定量PCR示Intelectin1mRNA的含量隨著CSE濃度的增加逐漸增加，10％CSE組Intelectin1mRNA的含量高于正常

3、組，同時(shí)，IL-6 mRNA的含量在10％CSE組下降，而Intelectin2和MCP-1mRNA的含量在三組間差異無顯著性。選用2.5％CSE分別刺激細(xì)胞8h、24h、72h后發(fā)現(xiàn)， 2.5％CSE刺激小鼠肺上皮細(xì)胞72h后Intelectin2 mRNA 含量增加，2.5％CSE 刺激24h后MCP-1mRNA含量下降，而Intelectin1和IL-6 mRNA的表達(dá)無改變。
　　 結(jié)論：Intelectin細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4、表明，CSE 刺激小鼠肺上皮細(xì)胞后，Intelectin-1和-2表達(dá)增加，IL-6和 MCP-1的表達(dá)下降，CSE對(duì)這些因子表達(dá)的不同影響可能和香煙煙霧刺激的濃度和時(shí)間的不同有關(guān)，需要進(jìn)一步在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以證明其在香煙致肺部炎癥中的作用。香煙煙霧刺激后，MLE-12細(xì)胞Intelectin的升高和IL-6、MCP-1的下降存在何種關(guān)系，也需要更進(jìn)一步的研究。
　　 第二部分 Intelectin在小鼠肺上皮細(xì)胞白介素6、單核細(xì)胞趨

5、化因子1表達(dá)中的作用
　　 目的：利用RNA干擾和基因過表達(dá)技術(shù)，探討intelectin是否參與了CSE下調(diào)肺上皮細(xì)胞MLE-12中IL-6、MCP-1的表達(dá)。
　　 方法：構(gòu)建intelectin1/2干擾質(zhì)粒PGCsi3.0-shRNA，其瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠肺上皮細(xì)胞MLE-12并用 CSE刺激24h后，定量PCR檢測(cè)intelectin1、intelectin2、IL-6和MCP-1mRNA的表達(dá)；另外采用高表達(dá)int

6、electin1cDNA的質(zhì)粒pEF-BOS-ITLN1-cDNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠肺上皮細(xì)胞MLE-12后，48h后檢測(cè)上述基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了intelectin1/2干擾質(zhì)粒，其能夠下調(diào)CSE刺激MLE-12細(xì)胞后的intelectin1的升高，而且，intelectin1/2 干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后能夠逆轉(zhuǎn)CSE引起的IL-6下降。高表達(dá)intelectin1cDNA的質(zhì)粒pEF-BOS-ITLN1-cDNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小

7、鼠肺上皮細(xì)胞MLE-12后，48h后檢測(cè)上述基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒可以明顯升高intelectin1的表達(dá)，而IL-6 mRNA卻明顯下降。
　　 結(jié)論：綜合RNA干擾和intelectin1cDNA 高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠肺上皮細(xì)胞MLE-12的結(jié)果，intelectin1參與了CSE下調(diào)小鼠肺上皮細(xì)胞MLE-12上IL-6 mRNA的表達(dá)。我們推論，CSE可以上調(diào)肺上皮細(xì)胞intelectin1的表達(dá)，增加的intelect

8、in1可以降低其IL-6的表達(dá)，下降的IL-6使肺泡上皮細(xì)胞的抗感染能力下降，IL-6引起的抗感染能力下降抵消甚至超過了intelectin1本身引起的抗感染能力的增加，這可能是CSE增加肺部感染的風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)原因。這些推論僅僅基于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，intelectin到底在香煙煙霧致肺部炎癥中發(fā)揮著怎樣的作用，需要我們進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行研究。
　　 第三部分慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)抑制煙熏小鼠肺組織Intelectin表達(dá)的

9、研究目的：探討intelectin在香煙煙霧致小鼠肺部炎癥中的作用。
　　 方法：構(gòu)建小鼠intelectin1/2 RNA干擾慢病毒載體，進(jìn)行病毒包裝，經(jīng)鼻滴入小鼠氣道以抑制煙熏小鼠肺組織intelectin的表達(dá)，隨后小鼠暴露于香煙煙霧4周，檢測(cè)肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)和分類細(xì)胞計(jì)數(shù)、觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變、氣道周圍炎癥改變，以及檢測(cè)肺組織中intelectin和白介素6的表達(dá)。
　　 結(jié)果：小鼠全身暴露于香煙煙霧4周后，

10、其肺部產(chǎn)生了亞急性炎癥，氣道周圍、肺泡炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加，肺組織Intelectin mRNA和蛋白水平增加，mRNA水平的增加主要體現(xiàn)在Intelectin2；肺臟的IL-6mRNA表達(dá)增加。此外，成功構(gòu)建了小鼠Intelectin1/2 RNA干擾慢病毒載體并包裝成功，在氣道上皮細(xì)胞用溶血磷脂膽堿（LPC）預(yù)處理后，慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾降低了肺臟Intelectin的水平，intelectin的降低并未引起白介素6的表達(dá)改變，也