探討冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張發(fā)生的相關(guān)機(jī)制及生長(zhǎng)分化因子-15的內(nèi)皮保護(hù)作用.pdf

1、研究目的
　　 1.通過(guò)回顧性研究，分析在我院行冠狀動(dòng)脈造影檢查并診斷現(xiàn)CAE的患者的臨床、冠脈造影結(jié)果及其臨床意義。
　　 2.通過(guò)測(cè)定與分析多種細(xì)胞分泌因子，包括一氧化氮（nitric oxide，NO）、內(nèi)皮素-1（endothelin，ET-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1（Tissue inhabitor of Metalloproteinase-1，TIMP-1）和生長(zhǎng)分化

2、因子-15（GDF-15）等的水平來(lái)初步探討這些因素在冠狀動(dòng)脈損傷如擴(kuò)張和狹窄的不同病程中參與的不同機(jī)制及可能發(fā)揮的關(guān)鍵作用。
　　 3.在基因水平上，對(duì)ACE Intron16 I/O，AT1R1166 A/C，MMP-91562 C/T及GDF-15-3148C/G五個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性研究，希望得到CAE和OCAD（Obstructivecoronary artery disease）的相關(guān)基因，從遺傳上探討兩種不同冠脈損

3、傷的差異。
　　 4.通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）分別加入不同濃度的葡萄糖、胰島素、HDL、LDL、oxLDL、Angll刺激不同時(shí)間，并應(yīng)用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（real time RT-PCR）方法探索對(duì)GDF-15轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平的影響，從而在體外研究水平上，探討GDF-15在內(nèi)皮細(xì)胞受到動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)危險(xiǎn)因素?fù)p傷過(guò)程中的

4、可能變化。
　　 5.利用GDF-15體外刺激HUVEC細(xì)胞，通過(guò)測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞的一氧化氮（NO）濃度以及一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），內(nèi)皮素（ET-1），細(xì)胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule，ICAM-1）和血管細(xì)胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule，VCAM-1）的表達(dá)水平，進(jìn)

5、一步研究不同濃度不同時(shí)間GDF-15刺激對(duì)內(nèi)皮功能的影響，揭示GDF-15對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞從代償?shù)綋p傷過(guò)程中的變化規(guī)律。
　　 研究方法
　　 1.收集于2005年1月支至2009年12月在我院心內(nèi)科行冠脈造影檢查并診斷為CAE的患者共48例，回顧性研究分析這些CAE患者臨床特點(diǎn)和冠脈造影結(jié)果，并對(duì)其進(jìn)行電話及門診隨訪，記錄臨床終點(diǎn)事件。
　　 2.收集CAE患者、冠心病（狹窄阻塞性病變）患者（obstructiv

6、e coronary arterydiseases，OCAD）及正常對(duì)照組（Normal coronary artery，NCA）記錄其臨床資料并收集血漿，采用ELISA方法測(cè)定所有研究對(duì)象的外周血NO，ET-1，MMP-9，TIMP-1和GDF-15的濃度。根據(jù)冠脈損傷的不同特點(diǎn)，將CAE組分為兩組：?jiǎn)渭児诿}擴(kuò)張組（Isolated coronary artery ectasia，ICAE）和冠脈擴(kuò)張合并狹窄阻塞性病變（coronar

7、y with both Ectasia and Stenosis，CAE+Stenosis）組，進(jìn)一步進(jìn)行各組間多種細(xì)胞分泌因子的濃度差異的比較研究。
　　 3.在基因水平，采用限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性，片段長(zhǎng)度多態(tài)性及直接測(cè)序等技術(shù)對(duì)所有研究對(duì)象的基因型ACE Intron16 I/D、AT1R1166 A/C、MMP-91562C/T及GDF-15-314SC/G進(jìn)行多態(tài)性分析。
　　 4.采用體外分離培養(yǎng)HUVE

8、C的方法，以HDL、LDL、oxLDL、Angll和信號(hào)通路阻斷劑SP600125、U0126、SB203580，以及葡萄糖、胰島素單獨(dú)或聯(lián)合刺激，設(shè)計(jì)不同的刺激濃度梯度和刺激時(shí)間，并通過(guò)Real-Time PCR檢測(cè)分析GDF-15轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　 5.GDF-15體外刺激HUVEC細(xì)胞，按GDF-15作用時(shí)間分為2組（36h和72h），每組5個(gè)濃度（0、400、600、800、1000、1500pg/mL），利用試劑盒

9、檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞上清的一氧化氮濃度，并利用Real-Time PCR分析一氧化氮合酶、內(nèi)皮素、細(xì)胞間粘附分子-1和血管細(xì)胞粘附分子-1的表達(dá)水平變化。
　　 6.用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；符合正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的，以中位數(shù)（25百分位-75百分位）表示，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)（百分比）表示，采用PearsonChi-Square檢驗(yàn)；P<

10、0.05（two-tailed）為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果
　　 1.CAE患者的臨床癥狀及危險(xiǎn)因素與因冠心病入院的患者無(wú)特殊性。
　　 2.CAE患者以單支病變19例（39.6％）為主，其中單支病變以RCA多見(jiàn)，雙支病變以LAD多見(jiàn)。CAE患者以LAD多見(jiàn)（71％）；RCA其次（67％）。CAE患者往往伴隨著冠脈動(dòng)脈粥樣硬化損傷，單純CAE28例（58.3％）；冠脈擴(kuò)張合并狹窄阻塞性病變20例（41.

11、70％）。
　　 3.CAE組NO水平高于OCAD組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p=0.007）。進(jìn)一步將CAE組分為ICAE組和CAE+Stenosis組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：ICAE組NO水平高于OCAD組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.022）；CAE+Stenosis組NO水平高于OCAD組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.014）。ET-1在各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　 4.CAE組MMP-9水平高于NCA組和OCAD組，并

12、且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.004和P=0.025）。進(jìn)一步將CAE組分為ICAE組和CAE+Stenosis組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：ICAE組MMP-9水平高于NCA組和OCAD組，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.007和P=0.027）；CAE+Stenosis組MMP-9水平高于NCA組，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.042）。NCA組TIMP-1水平顯著高于其他各組（P<0.05），但CAE組與OCAD組無(wú)顯著差異（P>0.05）。
　

13、　 5.CAE組GDF-15水平高于NCA組和OCAD組，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.045和P=0.037）。進(jìn)一步將CAE組分為ICAE組和CAE+Stenosis組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：CAE+Stenosis組GDF-15水平高于NCA組和OCAD組，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.008和P=0.014）；CAE+Stenosis組GDF-15水平高于ICAE組，但尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 6.ACE Intron16 I/

14、D，AT1R1166 A/C，MMP-91562 C/T及GDF-15-3148C/G在本研究的各組人群之間未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示這些位點(diǎn)可能與CAE發(fā)生過(guò)程無(wú)相關(guān)性。
　　 7.在本研究中MMP-91562 C/T多態(tài)性與血漿中MMP-9表達(dá)水平并無(wú)顯著相關(guān)性。
　　 8.在本研究中GDF-15-3148C/G多態(tài)性與血漿中GDF-15的表達(dá)水平無(wú)顯著相關(guān)性。
　　 9.HUVEC經(jīng)不同濃度LDL刺激12小時(shí)，

15、GDF-15的表達(dá)水平變化并不一致，但刺激24時(shí)均為使其表達(dá)量下調(diào)；HUVEC經(jīng)不同濃度HDL刺激12小時(shí)，GDF-15的表達(dá)水平變化并不一致，時(shí)間延長(zhǎng)至24小時(shí)上調(diào)GDF-15的表達(dá)，并且與HDL濃度升高成正比；不同濃度oxLDL刺激12或24小時(shí)后，均顯著上調(diào)GDF-15的表達(dá)，并呈時(shí)間依賴性，24小時(shí)后GDF-15的表達(dá)有所下降。
　　 10.高糖刺激12小時(shí)和24小時(shí)可增加GDF-15的表達(dá)；不同濃度胰島素作用12小時(shí)可

16、增加GDF-15的表達(dá)，低濃度組隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量升高；高糖和不同濃度胰島素聯(lián)合作用12及24小時(shí)均降低GDF-15的表達(dá)，低濃度胰島素組24小時(shí)表達(dá)量上升。
　　 11.不同濃度Angll刺激6小時(shí)、12小時(shí)后均上調(diào)HUVEC中GD-15的表達(dá)，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，作用24小時(shí)后最低和最高濃度的GDF-15表達(dá)量降低。加入SB203580后6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)GDF-15表達(dá)顯著升高。加入SP6001.25后6小時(shí)GDF

17、-15顯著升高，12小時(shí)后顯著降低，24小時(shí)后變化不顯著。加入U(xiǎn)0126后6小時(shí)GDF-15表達(dá)量升高，但12小時(shí)和24小時(shí)后GDF-15降低。
　　 結(jié)論
　　 1.CAE患者與OCAD患者臨床癥狀相似，以單支病變?yōu)橹?，其中單支病變以RCA為主，CAE患者往往伴隨著冠脈動(dòng)脈粥樣硬化損傷。
　　 2.冠脈擴(kuò)張可能是冠脈為了抵抗動(dòng)脈粥樣硬化而早期啟動(dòng)的機(jī)體正常的防御機(jī)制。單純冠脈擴(kuò)張可能是冠脈粥樣硬化損傷前期內(nèi)皮保

18、護(hù)功能亢進(jìn)階段。
　　 3.CAE與OCAD在MMP-91562 C/T和GDF-15-3148C/G基因多態(tài)性上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異并且與血漿MMP-9和GDF-15水平無(wú)相關(guān)性。
　　 4.多種危險(xiǎn)因素相關(guān)因子和物質(zhì)均可對(duì)HUVEC內(nèi)GDF-15的轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生一定的影響，結(jié)合GDF-15的抗炎癥反應(yīng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞過(guò)度增殖的保護(hù)作用，說(shuō)明GDF-15可以由內(nèi)皮細(xì)胞分泌并發(fā)揮一定的功能。
　　 5.體外實(shí)驗(yàn)