一個新的人間充質干細胞特異性表面抗原的鑒定和間充質干細胞亞群生物學特性的研究.pdf

1、間充質干細胞(MesenchymalStemCells，MSCs)是一種具有多向分化潛能的成體干細胞，是當前干細胞研究領域的熱點，在組織器官缺損性疾病、退行性疾病、自身免疫性疾病、遺傳缺陷等疾病的治療中有著巨大的臨床應用前景。隨著MSCs臨床應用的進程，對MSCs生物學特性的研究和認識提出了更高的要求。一直以來，骨髓MSCs被認為是骨髓單個核細胞中具有貼壁的特性、并可在體外培養(yǎng)增殖和誘導多向分化的非造血系統(tǒng)的干細胞。值得注意的是，迄今為

2、止MSCs尚未發(fā)現(xiàn)有特異性的表面分子。目前國際公認的MSCs表型特征為：細胞表面CD73、CD90、CD105等抗原呈陽性，而CD14、CD19、CD34、CD45、HLA—DR等造血譜系分子表達陰性。由于缺乏鑒定細胞的特異性標志，導致對MSCs的生物學特征缺乏嚴格統(tǒng)一的定義，制約了對MSCs生物學特性的研究和認識，使得MSCs的檢測、分離純化以及應用均面臨著巨大的難題。 第1章人間充質干細胞特異性單克隆抗體及其抗原特征的鑒定

3、 為發(fā)現(xiàn)新的MSCs特異的表面標志，以期深入研究MSCs的生物學特性，本研究以培養(yǎng)的人骨髓MSCs為免疫原免疫BALB/C小鼠，應用雜交瘤技術研究制備了具有自主知識產(chǎn)權的人骨髓MSCs特異性單克隆抗體ZUB1，并對ZUB1單克隆抗體及其識別抗原的生物學特性進行了深入研究。通過對抗體種屬和組織細胞特異性鑒定，證實ZUB1單克隆抗體針對人MSCs有高度的特異性和敏感性，ZUB1可識別骨髓、脂肪組織、臍帶組織和臍帶血來源的MSCs，與大

4、鼠、小鼠和兔骨髓MSCs均無交叉反應。Western—blot結果顯示，ZUB1單克隆抗體識別一種分子量約為250KD的抗原分子，該種抗原在13種人血液系統(tǒng)惡性疾病細胞株和10種人實體組織細胞株均無表達。骨髓、脂肪組織、臍帶組織和臍帶血來源的MSCs在傳代擴增過程中形態(tài)基本一致，流式細胞術檢測傳代擴增細胞表達ZUB1抗原的陽性率分別為97.58±0.68％、89.50±3.97％、96.63±1.23％、87.23±4.07％，此外CD

5、29、CD44、CD105、CD166、CD146陽性標記出現(xiàn)單峰，CD3、CD14、CD19、CD34、CD117、CD133、CD45、CD235a、HLA—DR均表達陰性，傳代細胞ZUB1抗原和其他各表面抗原表達均無顯著性差異。當誘導骨髓MSCs向成骨細胞和脂肪細胞定向分化時，流式細胞檢測顯示ZUB1抗原表達相應減弱，提示ZUB1抗原可作為MSCs干細胞特征的標志分子，且可能參與了MSCs分化的細胞活動。 為進一步鑒定ZU

6、B1單克隆抗體識別的抗原表位，我們通過Western—blot實驗證實ZUB1單克隆抗體識別的抗原分子量約為250KD，應用ZUB1單克隆抗體通過免疫沉淀的方法從人骨髓MSCs細胞裂解液中獲取與ZUB1抗體特異性結合的蛋白質，ZUB1抗體蛋白復合物經(jīng)SDS—PAGE電泳分離后切取蛋白質條帶，質譜分析提示ZUB1單克隆抗體識別的分子量為250KD的抗原肽段為非肌性肌球蛋白-9重鏈(non—musclemyosinheavychain9，N

7、MMHCⅡa)。生物信息學分析提示該類細胞骨架蛋白的同型異構體在不同組織和干細胞的不同分化階段有不同的異構體的表達，MSCs特異的形態(tài)特征和細胞骨架結構與其多向分化潛能是相適應的．該研究進一步豐富了對骨髓MSCs特異性分子特征的認識，也為進一步研究MSCs分化等細胞活動提供了一個重要的線索． 第2章ZUB1抗原陽性骨髓間充質干細胞亞群的鑒定和生物學特性的研究 隨著對體外培養(yǎng)MSCs的生物學特性認識的深入，研究者利用不同的

8、表面分子分離骨髓單個核細胞以期進一步研究和鑒定骨髓原始MSCs及其不同亞群的生物學特性。利用ZUB1單克隆抗體，我們建立了ZUB1+骨髓MSCs的分離培養(yǎng)體系，并深入研究了ZUB1+骨髓MSCs亞群的生物學特性。應用ZUB1單克隆抗體通過免疫磁珠分選骨髓單個核細胞，流式細胞儀檢測分選后細胞純度為61.52±6.69％，分選后獲得的ZUB1+骨髓單個核細胞體積較小、核質比大，符合干細胞的形態(tài)學特征。ZUB1+骨髓單個核細胞培養(yǎng)3天后細胞貼

9、壁呈梭形，5天后細胞擴增明顯，梭形貼壁細胞增殖呈集落樣分布，培養(yǎng)15天左右貼壁細胞達80％～90％匯合，細胞形態(tài)均一，且具有很好的增殖活性，細胞擴增至第8代細胞生長曲線無明顯差異。流式細胞術分析顯示ZUB1+骨髓單個核細胞貼壁培養(yǎng)后具有MSCs的表型特性，且可誘導向成骨細胞、脂肪細胞和神經(jīng)元樣細胞。因此，ZUB1單克隆抗體可用于分離富集ZUB1+骨髓MSCs亞群。 一直以來MSCs缺乏特異性分子標志，目前尚無有效的指標可以鑒定骨

10、髓中不同亞群的原始MSCs的含量。CFU—F可用于評估骨髓單個核細胞中MSCs集落的形成情況，也是目前用于評估骨髓中原始MSCs的數(shù)量的主要指標之一。將未分選的骨髓單個核細胞、及磁珠分選后ZUB1+和ZUB1-髓單個核細胞按2×104/cm2、1×103/cm2、2×104/cm2的細胞密度分別接種培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)15d，ZUB1+骨髓單個核細胞形成CFU—F的數(shù)量和直徑明顯多于未分選的骨髓單個核細胞，而ZUB1-骨髓單個核細胞未見集落形

11、成．按照每105單個核細胞計算ZUB1單克隆抗體分選骨髓單個核細胞的CFU—F富集指數(shù)(EnrichmentFactor)為193.09±32.81，且ZUB1+骨髓MSCs增殖較快。為進一步分析ZUB1+骨髓MSCs的表型特征，對MSCs公認的一系列表面分子檢測結果顯示該類細胞的表型一致：CD29、CD105、CD166、CD146表達陽性，而CD3、CD14、CD19、CD33、CD235a、HLA—DR、CD45、CD34、CD1

12、33、CD117為陰性。由此，我們認為ZUB1單克隆抗體可有效地富集骨髓單個核細胞中的MSCs，ZUB1抗原可以作為研究骨髓原始MSCs的分子標志；ZUB1+骨髓MSCs體外培養(yǎng)增殖較快，并可多向分化為成骨細胞、脂肪細胞和神經(jīng)元樣細胞。 本研究制備了具有自主知識產(chǎn)權的抗人骨髓MSCs特異性單克隆抗體，并證實ZUB1抗原針對人MSCs有高度的特異性，可用于人MSCs的檢測、鑒定以及富集骨髓中原始MSCs。ZUB1抗原為一種在MSC