百草枯中毒大鼠腎組織突變型P53和Fas-Fas-L的表達(dá)及促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的治療干預(yù)研究.pdf

1、目的:百草枯(paraquat,PQ)是目前世界范圍內(nèi)廣泛使用的有機(jī)雜環(huán)類接觸性除草劑。隨著百草枯在我國(guó)農(nóng)業(yè)上的廣泛應(yīng)用,PQ中毒也日趨增多。百草枯除草效果好,但對(duì)人畜均有較強(qiáng)毒性,可以經(jīng)消化道吸收、皮膚接觸及呼吸道吸入等途經(jīng)進(jìn)入體內(nèi),造成急性中毒,且中毒致死量小,病程發(fā)展快。百草枯進(jìn)入人體后,可引起多個(gè)臟器的損害,其中以肺臟為主,其次是腎臟和肝臟。目前尚缺乏百草枯特效解毒劑以及有效降低毒物毒性的治療手段。PQ主要以原形的形式經(jīng)腎臟排出

2、,因此了解其排泄機(jī)制及腎臟損傷機(jī)制非常重要。本研究通過觀察大鼠PQ染毒后腎組織病理變化、測(cè)定血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)的變化,及腎組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-PX)的活力和丙二醛(MDA)的含量,并采用免疫組織化學(xué)方法觀察腎組織中突變型P53蛋白、腫瘤壞死因子家族中Fas蛋白及其細(xì)胞表面受體Fas-L的表達(dá),以及促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(Hepatocyte Growth-promoting Fact

3、ors,pHGF)對(duì)其表達(dá)的影響,進(jìn)一步探討急性百草枯中毒導(dǎo)致腎損傷的機(jī)制及促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)PQ中毒大鼠腎損傷的治療作用。
　　 方法;選用健康成年Spragne-Dawley(SD)大鼠180只,雌雄各半,隨機(jī)分為3組:空白對(duì)照組(A組)60只、單純?nèi)径窘M(B組)60只、pHGF治療組(C組)60只。B、C組PQ(25mg/kg)腹腔注射染毒,A組等量生理鹽水腹腔注射,之后,C組立即給予pHGF1mg/kg腹腔注射,每12h一

4、次,最長(zhǎng)用藥時(shí)間為14天,B組給予與C組等量生理鹽水腹腔注射。各組分別于1d、3d、5d、7d、10d、14d,取10只大鼠,乙醚麻醉、腹主動(dòng)脈取血處死,血液離心后取血清以備測(cè)定血BUN、Cr水平;留取左腎上極組織,制成10％腎組織勻漿測(cè)定MDA的含量,SOD及GSH-Px的活力;右腎用10％甲醛固定,行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察病理學(xué)變化,免疫組化檢測(cè)腎組織中P53、Fas/Fas-L的表達(dá)。

5、r>　　 結(jié)果:
　　 1大鼠中毒表現(xiàn):于染毒30min～2hB組大鼠即出現(xiàn)不同程度的中毒癥狀,包括精神、神經(jīng)、呼吸、消化和泌尿系統(tǒng)等方面,主要表現(xiàn)為倦怠、嗜睡、煩躁、走路不穩(wěn)、頭顫;呼吸困難、進(jìn)食水減少、血尿少尿甚至無尿。癥狀以1～3d最明顯,3d后癥狀逐漸減輕。C組經(jīng)pHGF治療組中毒表現(xiàn)較B組減輕,呼吸困難改善,血尿減輕,少尿及無尿時(shí)間縮短。
　　 2血BUN、Cr測(cè)定(table1,Fig.53)
　　

6、 A組:血BUN、Cr各時(shí)段均在正常范圍內(nèi);
　　 B組:血BUN于第1天逐漸升高,1d、3d、5d各時(shí)間點(diǎn)與A組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);5d后存活大鼠血BUN逐漸下降,7～14d時(shí)段逐漸恢復(fù)正常,與A組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);
　　 C組:血BUN在1d、3d時(shí)段與A組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);5d、7d、10d、14d時(shí)段與A組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);1d、3d時(shí)段較B組降低,

7、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);5d、7d時(shí)段較B組降低,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05):三組Cr變化比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);
　　 3腎組織勻漿SOD、GSH-Px及MDA變化(table2,Fig.54-56)
　　 3.1 SOD活性檢測(cè)(Fig.55)
　　 B組:染毒后1d后明顯下降,之后緩慢升高,與A組相比,染毒后1d、3d二者差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),5d、7d時(shí)雖明顯低于A組

8、,但不再有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),10d、14d時(shí)間點(diǎn)SOD活力逐漸增高,與A組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);
　　 C組:促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素干預(yù)后SOD活力增加,染毒后1d、3d、5d、7d各時(shí)間點(diǎn)較B組升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);10d、14d時(shí)間點(diǎn)與B組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與A組相比,1d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),3d達(dá)高峰,之后維持在較高水平,5d開始呈下降趨勢(shì),3d、5d、7d、10d

9、、14d與A組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);
　　 3.2 GSH-Px活性檢測(cè)(Fig.56)
　　 B組:染毒后1d和3d時(shí)段低于A組(P＜0.05),5d及以后時(shí)段腎組織GSH-Px活力逐漸升高,與A組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);
　　 C組:促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素干預(yù)后GSH-Px活力增加,染毒后1d和3d時(shí)段較B組增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),所有時(shí)段與A組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05

10、);
　　 3.3 MDA含量測(cè)定(Fig.54)
　　 B組:1d、3d、5d、7d、10d時(shí)段均高于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),14d時(shí)段與A組相較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);
　　 C組:促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)大鼠腎組織MDA升高有抑制作用,1d和3d時(shí)段高于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),5d及以后各時(shí)段與A組相較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);1d、3d、5d、7d各時(shí)段較B組降低(P＜

11、0.05),10d及以后時(shí)段與B組相較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);
　　 4腎組織HE染色結(jié)果
　　 A組(Fig.1):腎小球、腎小管及腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰,未見水腫、空泡變性、濁腫及壞死;
　　 B組((Fig.2-7):與A組相比,B組各組織結(jié)構(gòu)清晰度下降,染毒后1d皮質(zhì)部小管上皮細(xì)胞腫脹,小管管腔狹小,間質(zhì)充血、水腫,腎小球內(nèi)可見紅細(xì)胞輕度增多,隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重;
　　 C組((Fig.8-13):與

12、B組相比,C組腎小球充血水腫減輕,腎小管上皮細(xì)胞損傷減輕,3d時(shí)即可見再生上皮細(xì)胞,腎間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 5免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果(table3,Fig.14-52)
　　 5.1 Fas蛋白在大鼠腎組織中的表達(dá)與分布
　　 A組(Fig.14):Fas蛋白無表達(dá)或有微弱表達(dá),主要分布在腎小管上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中;
　　 B組(Fig.15-20):染毒后1d腎組織中Fas的表達(dá)即明顯強(qiáng)于A組(P＜0

13、.05),主要分布在腎小管上皮細(xì)胞的胞漿中,其表達(dá)呈持續(xù)高水平,7d有所下降,至14d仍高于A組(P＜0.05)。
　　 C組(Fig.21-26):促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素抑制了染毒大鼠腎組織中Fas的表達(dá),與B組比較1d時(shí)段無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),3d至14d各時(shí)段則有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與A組比較所有時(shí)段均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5.2 Fas-L蛋白在大鼠腎組織中的表達(dá)與分布
　　 A組

14、(Fig.27):Fas-L蛋白無表達(dá)或有微弱表達(dá),主要分布在腎小管上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中;
　　 B組(Fig.28-33):染毒后1d腎組織中Fas-L的表達(dá)即明顯強(qiáng)于A組(P＜0.05),主要分布在腎小管上皮細(xì)胞的胞漿中,其表達(dá)呈持續(xù)高水平,10d有所下降,至14d仍高于A組(P＜0.05)。
　　 C組(Fig.34-39):促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素抑制了染毒大鼠腎組織中Fas-L的表達(dá),與B組比較1d時(shí)段無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.

15、05),3d至14d各時(shí)段則有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與A組比較所有時(shí)段均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5.3突變型P53在大鼠腎組織中的表達(dá)與分布
　　 A組(Fig.40):突變型P53無表達(dá)或有微弱表達(dá),主要分布在腎小管上皮細(xì)胞的胞核中。
　　 B組(Fig.41-46):大鼠在染毒1d腎組織中突變型P53的表達(dá)即明顯強(qiáng)于A組(P＜0.05),主要分布在腎小管上皮細(xì)胞的胞核中,其表達(dá)呈持續(xù)高水平

16、,10d有所下降,至14d仍高于A組(P＜0.05)。
　　 C組(Fig.47-52):促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素明顯抑制了染毒大鼠腎組織中突變型P53的表達(dá),與B組比較所有時(shí)段均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),與A組比較所有時(shí)段均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1百草枯腹腔注射染毒可引起急性腎損傷,且主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞的損傷;
　　 2百草枯中毒大鼠體內(nèi)MDA含量升高、SOD活力下降及GS

17、H-Px活力先降后升,說明過氧化損傷及氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡是造成腎損傷的重要機(jī)制之一;
　　 3突變型P53和Fas/Fas-L在染毒大鼠腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)發(fā)生了明顯改變,說明細(xì)胞凋亡可能是百草枯中毒腎損傷的機(jī)制之一;
　　 4應(yīng)用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素治療后,可以增加百草枯中毒大鼠腎組織中SOD及GSH-Px活力,降低MDA含量,從而減輕腎組織的過氧化損傷;
　　 5促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素可能通過抑制由突變型P53和Fas/