土壤消毒及土傳病原真菌的分子生物學(xué)鑒定.pdf

1、本研究旨在篩選溴甲烷土壤消毒的有效替代品，并探討快速有效的分子生物學(xué)方法定性定量研究土傳病原真菌，綜合評(píng)價(jià)土壤消毒的藥效，為土壤消毒防治土傳病害提供更為科學(xué)的依據(jù)。通過常規(guī)的病原菌分離培養(yǎng)方法分離重要的土傳病原真菌，采用改進(jìn)的冷凍研磨CTAB法提取基因組DNA，對真菌核糖體基因的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internaltranscribedspacer，ITS)進(jìn)行克隆測序，設(shè)計(jì)特異性引物，并進(jìn)行引物特異性及靈敏性檢驗(yàn)。根據(jù)所設(shè)計(jì)的特異性引物，采

2、用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對硫酰氟處理后土樣中病原真菌進(jìn)行定性定量研究，并結(jié)合病原菌傳統(tǒng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)的方法，綜合評(píng)價(jià)硫酰氟土壤消毒對土傳病原真菌的控制效果。通過本研究，得到如下結(jié)果： (1)采用不同劑量的硫酰氟室內(nèi)土壤熏蒸，結(jié)果表明硫酰氟用量在5.44×10-2g/L～43.52×10-2g/L對土壤中尖鐮刀菌有很好的防效，與本室所做的硫酰氟田間藥效試驗(yàn)結(jié)果相一致，說明硫酰氟是很有潛力的土壤熏蒸劑。 (2)從采集的保護(hù)地病土與

3、典型病組織中成功分離到辣椒疫霉，番茄晚疫病菌，尖鐮刀菌，瓜果腐霉，鏈格孢。并收集培養(yǎng)了寄生疫霉，苧麻疫霉，棉尖鐮孢，燕麥鐮孢，串珠鐮孢，禾谷鐮孢，腐皮鐮孢，大麗輪枝菌，番茄灰霉等菌株。 (3)對冷凍研磨CTAB法進(jìn)行改進(jìn)后，成功提取多種真菌的基因組DNA。并對腐皮鐮孢，分離的鐮刀菌，辣椒疫霉，番茄晚疫病菌，大麗輪枝菌，瓜果腐霉的ITS區(qū)進(jìn)行克隆測序，結(jié)果顯示其長度分別為544bp，544bp，793bp，884pb，541bp，

4、866bp。經(jīng)序列比對，結(jié)果顯示腐皮鐮刀菌和分離的鐮刀菌均與尖鐮刀菌的一個(gè)?；虵usariumoxysporumf.sp.meloni同源性高達(dá)99％以上，推測它們的分類地位可能都應(yīng)歸屬于Fusariumoxysporumf.sp.meloni.其余菌株序列比對，結(jié)果顯示其種屬名均與GenBank中報(bào)道的一致。 (4)對分離的鐮刀菌，辣椒疫霉，大麗輪枝菌三種重要土傳病原真菌設(shè)計(jì)了特異性引物，kfu1/kfu2，ljym1/lj

5、ym2，dllz1/dllz2，并進(jìn)行引物的特異性及靈敏性檢驗(yàn)，結(jié)果表明退火溫度均為65℃時(shí)，三對引物均具有良好的特異性和靈敏性。 (5)以不同劑量硫酰氟處理后的土樣為樣本，根據(jù)所設(shè)計(jì)的特異性引物，采用熒光定量PCR方法對土樣中病原真菌進(jìn)行定性定量研究。結(jié)果表明，可準(zhǔn)確定量不同處理土樣中尖鐮刀菌的rDNA拷貝數(shù)，顯示硫酰氟對該菌有很好的控制效果，并明確了尖鐮刀菌是滿城草莓病害一個(gè)重要致病菌，初步形成了土傳病原真菌快速有效的分子檢