實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚病原真菌分子生物學(xué)檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、No20032323河暗蓮科六蠆碩士研究生畢業(yè)論文實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚病原真菌分子生物學(xué)檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用研究生導(dǎo)師專業(yè)二級(jí)學(xué)院研究起止日期提交同期龔巧玲劉福英教授劉軍須副教授生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2004年9月一2006年3月2006年3月中文摘要養(yǎng)物，接種于沙氏液體培養(yǎng)基，置27℃恒溫?fù)u床80轉(zhuǎn)／分振蕩培養(yǎng)10天。將培養(yǎng)液倒入100ml離心管內(nèi)離心，沉淀裝入15mlEp管中，70℃或液氮保存。取以上冷凍保存的三種菌沉淀物少量(各約

2、1Omg)用破壁酶破壁，使用酚氯仿抽提法抽提DNA；然后用皮膚病原真菌通用引物(CHS11S，CHS11R)和隨機(jī)引物(FMl)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒別三種皮膚真菌標(biāo)準(zhǔn)菌株。2通用引物PCR特異性及敏感性測(cè)定特異性測(cè)定：用皮膚病原真菌通用引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增大腸桿菌DNA(化學(xué)裂解法提取)、犬肝炎病毒DNA及小鼠肝癌H22細(xì)胞DNA(由本室提供)。敏感性測(cè)定：DNA提取方法同上，以紫外分光光度法測(cè)定DNA質(zhì)量濃度，根據(jù)測(cè)定值將DNA進(jìn)行1O

3、倍系列質(zhì)量濃度稀釋，得到100ng一10龜?shù)?個(gè)質(zhì)量濃度，然后對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3皮膚病原真菌動(dòng)物模型的建立：取三種標(biāo)準(zhǔn)菌株傳種到沙氏斜面固體培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)1O天。取下菌落加適量滅菌生理鹽水制成菌懸液，用劃痕法建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚病原真菌動(dòng)物模型。4使用分子生物學(xué)方法及傳統(tǒng)方法檢測(cè)皮膚病原真菌：用接種鏟從建立的動(dòng)物模型身上刮取毛發(fā)及鱗屑于沙氏斜面固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，2～3天后菌落長(zhǎng)出，從培養(yǎng)基上刮取菌落提取DNA及用通用引物PCR擴(kuò)增鑒