三羥異黃酮對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)人胰島腺癌細(xì)胞Panc-1侵襲影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言：
　　 胰腺癌是一種惡性程度較高、預(yù)后極差的腫瘤,其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈逐漸上升趨勢(shì)。胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制是研究的重點(diǎn)。探討其有關(guān)分子機(jī)制并尋找阻斷相關(guān)信號(hào)通路的藥物,對(duì)提高胰腺癌的治療效果具有重要的理論指導(dǎo)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。。
　　 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β家族成員之一,具有廣泛的生物學(xué)活性。它在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中擔(dān)任雙

2、重角色。在腫瘤早期,主要通過(guò)TGF-β1經(jīng)典的Smads通路介導(dǎo)發(fā)揮細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用,其中Smad4是該通路中的關(guān)鍵分子,參與信號(hào)的入核過(guò)程。而在腫瘤晚期,。rGF-β1通過(guò)Smad4非依賴通路促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。TGF-β1主要通過(guò)降低胰腺癌細(xì)胞粘附力、增加細(xì)胞外基質(zhì)降解以及誘導(dǎo)上皮向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化等作用促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　 三羥異黃酮(Genistein)是大豆組成成分之一,具有酪氨酸蛋白激酶抑制劑等多種抗癌作用。它不僅

3、可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤生長(zhǎng),還可以抑制腫瘤細(xì)胞(如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等)的侵襲和轉(zhuǎn)移。目前,Genisteln在胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中作用的研究相對(duì)較少。實(shí)驗(yàn)表明:Genistein可以改變胰腺癌細(xì)胞基因表達(dá)、抑制移植裸鼠轉(zhuǎn)移的作用。盡管Genistein抗癌作用的確切分子機(jī)制仍不清楚,但它具有抑制腫瘤侵襲的現(xiàn)象已被大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)。為了進(jìn)一步探討Genisteiln在胰腺癌侵襲過(guò)程中的作用機(jī)制,我們應(yīng)用TGF-β

4、1誘導(dǎo)的人胰腺癌細(xì)胞Panc-1作為體外誘導(dǎo)侵襲模型,分別在細(xì)胞外基質(zhì)降解酶、細(xì)胞上皮間質(zhì)變、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)等方面,探討Genistein是否具有對(duì)抗TGF-β1促侵襲的作用,這不僅可以更加深刻的認(rèn)識(shí)胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移規(guī)律,還可以進(jìn)一步揭示Genisteln作用機(jī)理,為其將來(lái)應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。
　　 目的：
　　 通過(guò)研究Genisteln對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的人胰腺癌細(xì)胞Panc-1侵襲力及其相關(guān)因素

5、的影響,探討其在TGF-β1介導(dǎo)的信號(hào)通路中發(fā)揮的作用,期望為揭示Genisteln作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論參考。
　　 方法：
　　 本實(shí)驗(yàn)采用人胰腺癌細(xì)胞Panc-1為非Smad4純合子缺失細(xì)胞系,對(duì)TGF-β1有良好的反應(yīng)性,是目前國(guó)內(nèi)外用于胰腺癌體外實(shí)驗(yàn)研究常用的細(xì)胞。
　　 采用Transwell小室法檢測(cè)三羥異黃酮對(duì)不同刺激條件下(5ng/ml誘導(dǎo)24小時(shí)和10ng/ml誘導(dǎo)48小時(shí))TGF-β1誘

6、導(dǎo)的Panc-1細(xì)胞侵襲力和遷徙力的變化;采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)尿激酶型纖溶蛋白酶原激活物(uPA)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和9(MMP-9)、波形蛋白(Vimentin)、E-鈣依賴粘附素(E-Cadherin)及Smad4的mRNA表達(dá);采用Westernblot蛋白印記法檢測(cè)uPA、E-Cadherin、P38、磷酸化P38、ERK1/2蛋白表達(dá)和采用明膠酶譜法檢測(cè)MMP-2和MMP-9蛋白活性的表達(dá)。采用顯微鏡觀

7、察細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變。
　　 結(jié)果：
　　 論文一:Genistejn對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)Panc-1細(xì)胞uPA及MMP-2/9表達(dá)的影響
　　 1、與空白對(duì)照組相比,TGF-β1刺激組(5ng/ml誘導(dǎo)24小時(shí))通過(guò)Tanswell小室人工膜細(xì)胞數(shù)量明顯增加,其中侵襲實(shí)驗(yàn)60.92±10.71VS34.20±5.52(P＜0.05),遷徙實(shí)驗(yàn)67.42±9.09VS40.36±6.10(P＜0.05);uPA、MMP

8、-2mRNA和uPA蛋白表達(dá)增加(P＜0.05);MMP-2活性表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.01),MMP-9表達(dá)無(wú)顯著性差異。
　　 2、與TGF-β1刺激組相比,各治療組通過(guò)人工膜細(xì)胞數(shù)減少,其中侵襲實(shí)驗(yàn):各組細(xì)胞數(shù)為49.03±7.93、37.12±6.27、24.09±3.90,各治療組抑制率明顯增加(P＜0.05),并與濃度呈正比,在GeMsteln濃度為50μmol/L(治療③組)時(shí)P＜0.01;遷徙實(shí)驗(yàn):各組細(xì)胞數(shù)58.

9、63±9.49、43.56±7.07、27.26±4.36,當(dāng)Genistein濃度為25μmol/L時(shí),抑制率組間差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),濃度為50μmol/L時(shí)抑制率更高(P＜0.01)。
　　 3、與TGF-β1刺激組相比,各治療組uPAmRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05),具有濃度依賴性,當(dāng)Genistein濃度為50μmol/L時(shí)(治療③組)差別更明顯(P＜0.01):uPA蛋白表達(dá)減少,其中治療②、③組差

10、別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);當(dāng)Genistein濃度為25μmol/L時(shí)可以明顯抑制MMP-2mRNA及活性表達(dá),治療③組差別顯著(P＜0.01);MMP-9mRNA及活性表達(dá)各組無(wú)顯著性差異。
　　 論文二:Genistein對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)Panc-1細(xì)胞EMT的影響
　　 1、與空白對(duì)照組相比,TGF-β1刺激組(10ng/ml誘導(dǎo)48小時(shí))通過(guò)Tanswell小室人工膜細(xì)胞數(shù)量明顯增加(99.16±11.

11、30VS65.46±8.99;P＜0.05)E-CadherinmPNA和蛋白表達(dá)下降,VimentinmRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.05),顯微鏡下細(xì)胞分散,連接松散,部分細(xì)胞呈梭形。
　　 2、與TGF-β1刺激組相比,各治療組通過(guò)人工膜細(xì)胞數(shù)分別為49.03±7.93、37.12±6.27、24.09±3.90,當(dāng)Genistein濃度為50μmol/L時(shí)(治療③組)抑制率顯著增加(P＜0.05);治療組E-Cadheri

12、nmRNA表達(dá)增加在濃度為25μmol/L(治療②組)時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05):Genistein對(duì)E-Cadherin蛋白表達(dá)的增加呈劑量效應(yīng)趨勢(shì),當(dāng)濃度為1μmol/L時(shí)組間即有顯著性差異(P＜0.05),當(dāng)濃度增加時(shí)(治療③組)作用更加顯著P＜0.01;對(duì)VimentinmRNA表達(dá)的影響,治療②、③組表達(dá)降低有顯著性差別(P＜0.05);在Genistein濃度為50μmol/L時(shí)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)間質(zhì)樣特性減輕。

13、　　 論文三:Genistein在TGF-β1介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路中的作用
　　 1、與空白對(duì)照組相比,TGF-β1刺激組細(xì)胞Smad4mRNA表達(dá)、P-P38蛋白表達(dá)明顯增加,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),而P38、ERK1/2蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變(P＞0.05)。
　　 2、與TGF-β1刺激組相比,在Genistein濃度為25μmol/L時(shí)抑制細(xì)胞Smad4mRNA表達(dá)及磷酸化P38蛋白表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別,當(dāng)濃

14、度為50μmol/L時(shí)(治療③組)抑制磷酸化P38蛋白表達(dá)的作用更加顯著(P＜0.01);各組ERK1/2和P38蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差別(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、外源性TGF-β1可以通過(guò)增加細(xì)胞外基質(zhì)降解及促細(xì)胞上皮間質(zhì)變的作用使人胰腺癌細(xì)胞Panc-1侵襲和遷徙能力增強(qiáng)。
　　 2、Genisteln通過(guò)抑制uPA、MMP-2的表達(dá)降低TGF-B1誘導(dǎo)的人胰腺癌Panc-1細(xì)胞的侵襲和遷徙能力