慢病毒介導(dǎo)的TGF-β1 siRNA對新生小鼠高氧肺損傷保護作用的體內(nèi)初步研究.pdf

1、支氣管肺發(fā)育不良（Bronchopulmonary dysplasia，BPD）是早產(chǎn)兒最主要的死亡原因之一。存活的患兒則多殘留阻塞性氣道疾病，肺動脈高壓以及嚴重的生長發(fā)育遲滯。盡管近20年來隨著早產(chǎn)兒重癥監(jiān)護技術(shù)和肺表面活性物質(zhì)的運用，早產(chǎn)兒存活率已顯著提高，但BPD的發(fā)生率卻有增無減。目前仍缺乏對BPD的根本性治療手段，探索其病理機制、尋找更好的治療手段一直是亟待解決的難題。目前研究認為持續(xù)高體積分數(shù)氧（高氧）吸入致肺損傷是BPD的

2、明確病因之一，但其病理機制并不清楚。研究發(fā)現(xiàn)在BPD支氣管肺泡灌洗液或肺組織中轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表達明顯升高，但目前缺乏系統(tǒng)的相關(guān)研究。慢病毒載體具有感染細胞種類廣泛，感染能力穩(wěn)定，表達時限長的優(yōu)勢，而小分子干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）具有特異沉默目的基因的特點。本研究用慢病毒介導(dǎo)的siRNA技術(shù)，在新生昆明小鼠高氧吸入前

3、直至吸入后一個月的肺組織發(fā)育關(guān)鍵時期，活體內(nèi)持續(xù)抑制TGF-β1的高表達，以研究其對新生小鼠持續(xù)高氧吸入所致肺損傷是否具有保護作用。 第一章、靶向TGF-βi小分子干擾RNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定。 目的：以小分子干擾RNA技術(shù)構(gòu)建小鼠TGF-β1-shRNA慢病毒載體，并在肺泡二型上皮細胞（Alveolar epithelial cellsⅡ，AECⅡ）中行體外干擾效率鑒定。 方法：分別設(shè)計TGF-β1-shR

4、NA干擾序列及陰性對照序列，BLAST驗證基因同源性。設(shè)計的序列經(jīng)體外退火形成雙鏈寡核苷酸，將其與以BamH1／Xho1酶切后的載體pRNAT-u6．2連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，小量抽提質(zhì)粒后測序鑒定。得到的陽性質(zhì)粒以Xho1和Xba1雙酶切，回收其中7010bp條帶作為載體。載體PKG-RFP以Xho1和Nhe1雙酶切，回收其中1262bp作為目的基因片段純化，以上兩片段連接重組，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，抽提質(zhì)粒。以BamH1單酶

5、切鑒定，釋放出600bp條帶為正確的克隆質(zhì)粒，即為重組慢病毒載體。將慢病毒包裝系統(tǒng)三質(zhì)粒和重組慢病毒載體混合，導(dǎo)入293T細胞，包裝成病毒后，采集病毒上清液，采用系列梯度稀釋法，G418藥物篩選測定病毒滴度。同法構(gòu)建陰性干擾慢病毒載體。將包裝好的病毒轉(zhuǎn)染AEC Ⅱ，分為干擾組，陰性干擾組和空白對照組3組，每組5復(fù)孔，干擾組和陰性干擾組分別加入構(gòu)建的干擾載體和陰性干擾載體，空白對照組加入等量不含病毒的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染96h后提取細胞蛋白質(zhì)，以

6、Western Blot檢驗TGF-β1蛋白表達驗證慢病毒載體干擾效率。并分別取3實驗組AEC Ⅱ細胞滴片，以TGF-β1多克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC標記的山羊抗兔IgG為二抗，間接免疫熒光法觀察TGF-β1表達情況。采集的數(shù)據(jù)用SPSS13．0統(tǒng)計軟件行單因素方差分析，多重比較用SNK法。 結(jié)論：成功構(gòu)建小鼠TGF-β1-shRNA慢病毒載體pU6．2-TGF-RFP-Lenti。其可有效抑制AEC Ⅱ TGF-β1蛋白的表達。

7、 第二章、活體內(nèi)沉默TGF-β1基因?qū)π∈蠓闻莅l(fā)育的影響。 目的：探討活體內(nèi)將慢病毒載體導(dǎo)入小鼠肺內(nèi)的方法和沉默肺TGF-β1基因?qū)π律∈笸砥诜闻莅l(fā)育的影響。 方法：清潔級1日齡新生昆明小鼠75只，隨機分為干擾組，空白對照組和陰性對照組3組，每組25只，于生后第3天（Postnatal days 3，以P3表示，下同）經(jīng)鼻內(nèi)吸入法將構(gòu)建好的TGF-β1-shRNA慢病毒載體導(dǎo)入干擾組新生小鼠肺內(nèi)，將陰性對照慢病

8、毒載體同法導(dǎo)入陰性對照組小鼠肺內(nèi)，空白對照組不予干預(yù)。各組按小鼠生后4，7，14，21，28天分別殺取5只小鼠取肺組織。左肺制作冰凍切片于激光共聚焦顯微鏡下觀察肺組織紅色熒光蛋白RFP的表達情況。左肺制作石蠟切片于光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化，計算肺泡平均截距（Mean linear intercept，MLI）代表肺泡腔內(nèi)徑大小，計算放射狀肺泡計數(shù)（Radical alveolar counts，RAC）表示肺泡數(shù)目。取右肺采用逆轉(zhuǎn)錄聚

9、合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測肺組織中TGFβ-1 mRNA表達水平。以Western Blot法檢測肺組織中TGF-β1蛋白表達水平。數(shù)據(jù)統(tǒng)計用SPSS13．0軟件行析因方差分析，多重比較用SNK法。 結(jié)論：活體內(nèi)鼻內(nèi)吸入法可有效將慢病毒載體導(dǎo)入肺內(nèi)，沉默新生小鼠肺組織TGF-β1表達可導(dǎo)致新生小鼠晚期肺泡發(fā)育過程阻滯。

10、第三章、小鼠支氣管肺發(fā)育不良動物模型的建立及其肺組織TGF-β1、Smad 4的相關(guān)變化。 目的：以高體積分數(shù)氧吸入的方法制作小鼠支氣管肺發(fā)育不良模型，研究高氧新生小鼠肺組織結(jié)構(gòu)和TGF-β1、Smad4的變化情況。 方法：清潔級1日齡新生昆明小鼠50只，于生后3天（Postnatal days 3，以P3表示，下同）隨機分為高氧組和對照組兩組，每組各25只。P4～P14將高氧組小鼠連同授乳母鼠一起置于自制氧箱內(nèi)飼養(yǎng)。維

11、持氧箱內(nèi)氧氣體積分數(shù)為600ml/L，以鈉石灰吸附CO2，使其體積分數(shù)低于5ml/L。供氧10天后恢復(fù)為空氣條件飼養(yǎng)。空氣組僅置空氣條件下飼養(yǎng)；按P4，7，14，21，28每時間點各組分別殺取5只小鼠取肺組織，左肺制作石蠟切片，以HE染色法觀察肺組織結(jié)構(gòu)變化，計算肺泡平均截距（Mean linear intercept，MLI）代表肺泡腔內(nèi)徑大小，計數(shù)放射狀肺泡計數(shù)（Radical alveolar counts，RAC）表示肺泡數(shù)目；

12、制作超薄切片，透射電鏡觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)變化；以兔抗小鼠TGF-β1多克隆抗體為一抗，SABC免疫組織化學(xué)法觀察TGF-β1在肺組織的表達情況；取右肺以RT-PCR法檢測肺組織中TGFβ-1和Smad4 mRNA表達水平。數(shù)據(jù)統(tǒng)計用SPSS13．0行兩獨立樣本t檢驗。 結(jié)論：成功建立新生小鼠高氧BPD模型。高氧吸入可導(dǎo)致肺組織TGF-β1和Smad4異常高表達，TGF-β1/Smad通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)上調(diào)是支氣管肺發(fā)育不良重要的病理機

13、制之一。 第四章、慢病毒介導(dǎo)TGF-β1 siRNA對新生小鼠高體積分數(shù)氧吸入致肺損傷的保護作用。 目的：探討慢病毒介導(dǎo)的小分子干擾RNA技術(shù)抑制TGF-β1基因?qū)Ω唧w積分數(shù)氧所致新生小鼠肺損傷是否具有保護作用。 方法：清潔級1日齡新生昆明小鼠100只，隨機分為高氧組，干擾組，陰性干擾組和空氣組4組，每組各25只，于生后3天（Postnatal days 3，以P3表示，下同）以鼻內(nèi)吸入法將構(gòu)建好的TGF-β1s

14、hRNA慢病毒載體及陰性對照載體分別導(dǎo)入干擾組和陰性干擾組小鼠肺內(nèi)。P4～P14天將高氧組、干擾組和陰性干擾組置于氧箱內(nèi)飼養(yǎng)。維持氧箱內(nèi)氧體積分數(shù)為600ml/L，CO2體積分數(shù)低于5ml/L。空氣組不予任何干預(yù)；按小鼠生后4，7，14，21，28天每時間點各組分別殺取5只動物，左肺制作石蠟切片，HE染色觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化，計算肺泡平均截距（Mean linear intercept，MLI）代表肺泡腔內(nèi)徑大小，計算放射狀肺泡計數(shù)（R

15、adical alveolar counts，RAC）表示肺泡數(shù)目；以SP-C和AQP5單克隆抗體為一抗，SABC免疫組織化學(xué)法檢測肺組織SP-C和AQP5表達情況；左肺制作冰凍切片，以FITC標記的荊豆凝集素（Ulex europaeus agglutinin 1，UEA-1）孵育后激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光表達情況；取右肺采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reac

16、tion，RT-PCR）法檢測肺組織中TGF-β1和Collegan Ⅰ mRNA表達水平；以Western Blot法檢測肺組織中TGF-β1蛋白表達水平。采集的數(shù)據(jù)用SPSS13．0統(tǒng)計軟件行析因方差分析，多重比較用SNK法。 結(jié)論：慢病毒載體介導(dǎo)的TGF-β1 小分子干擾RNA對高體積分數(shù)氧吸入所致新生小鼠肺損傷有保護作用。抑制TGF-β1的異常高表達從而調(diào)節(jié)AECⅡ向AEC Ⅰ的正常分化，促進細胞外基質(zhì)正常降解，減輕肺微