高氧肺損傷形成過程中小窩蛋白-1、TGF-β1表達(dá)關(guān)系的體內(nèi)外研究.pdf

1、目的:通過建立高氧肺損傷動(dòng)物模型和體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法,從體內(nèi)和體外兩方面來研究小窩蛋白-1(Caveolin-1)和TGF-β1與高氧肺損傷纖維化之間的關(guān)系,以探討高氧肺損傷纖維化的發(fā)病機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將剖宮術(shù)取出孕21d大鼠作為早產(chǎn)鼠為研究對(duì)象,制成早產(chǎn)鼠高氧肺損傷模型。實(shí)驗(yàn)將早產(chǎn)大鼠分為兩個(gè)組:對(duì)照組(n=15)、實(shí)驗(yàn)組(n=15)。兩組分別于暴露滿1、3、7d時(shí)隨機(jī)選取早產(chǎn)鼠5只麻醉后處死,

2、行肺灌洗后,將肺組織完整取出后制成石蠟切片,應(yīng)用蘇木精-伊紅染色觀察不同時(shí)間點(diǎn)肺組織病理改變,在光鏡下進(jìn)行肺組織纖維化評(píng)分,并采用免疫組織化學(xué)SP法(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)肺組織小窩蛋白-1、TGF-β1的表達(dá)部位和強(qiáng)度。
　　 2.體外實(shí)驗(yàn)以人肺上皮細(xì)胞系A(chǔ)549為模型細(xì)胞,建立高氧A549細(xì)胞損傷模型。實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組置于5％CO2培養(yǎng)箱中；實(shí)驗(yàn)組置于5％CO2～95％O

3、2的混合氣中培養(yǎng)。兩組分別于處理后12、24、48h收集細(xì)胞檢測(cè)如下指標(biāo):普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；采用免疫熒光雙染檢測(cè)小窩蛋白-1、TGF-β1表達(dá)的相關(guān)性,用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。
　　 結(jié)果:
　　 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)肺組織病理改變:對(duì)照組1、3、7d比較,肺組織發(fā)育逐漸成熟,肺泡結(jié)構(gòu)逐漸規(guī)整,大小均勻一致,肺泡間隔變薄,各時(shí)間點(diǎn)肺組織形態(tài)無明顯改變。與對(duì)照組比較,高氧暴露第1d,無較大差異；高氧

4、暴露第3d,肺泡腔內(nèi)有少許紅細(xì)胞滲出及肺泡間隔有以中性粒細(xì)胞為主的浸潤；高氧暴露第7d,肺損傷較重,可見較多的炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞,肺發(fā)育受阻,肺組織結(jié)構(gòu)紊亂,出現(xiàn)肺纖維化傾向。(2)肺組織小窩蛋白-1、TGF-β1的表達(dá):小窩蛋白-1在對(duì)照組早產(chǎn)大鼠肺組織中均有較高水平表達(dá)。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組肺組織Caveolin-1的表達(dá)出現(xiàn)降低,在3d,7d明顯降低,差異有顯著性(31.21±4.04 vs46.20±3.50；19.94±5.58

5、 vs43.26±4.12,P<0.05),其與纖維化評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.88、-0.93,P<0.05)；TGF-β1在對(duì)照組早產(chǎn)大鼠肺組織中均有較低水平表達(dá)。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組肺組織TGF-β1的表達(dá)出現(xiàn)升高,在3d,7d明顯升高,與對(duì)照組比較差異有顯著性(20.45±2.75vs16.53±1.69；35.78±2.28vs17.05±3.42,P<0.05),其與纖維化評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.82、0.87,P<0.05)。

6、相同時(shí)間點(diǎn)小窩蛋白-1的陽性表達(dá)與TGF-β1的陽性表達(dá)有負(fù)相關(guān),以對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組1d、7d最顯著(r=-0.91,-0.86,-0.63,-0.82,P<0.05)。
　　 2.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)A549細(xì)胞形態(tài)變化:倒置相差顯微鏡下觀察,對(duì)照組A549細(xì)胞貼壁良好,為扁圓的多角形,細(xì)胞排列緊密,連接成片,胞體明亮,數(shù)量多,懸浮細(xì)胞較少,呈現(xiàn)良好的生長狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞受損明顯,由典型的扁圓多角形細(xì)胞變?yōu)閳A形或橢圓形,細(xì)胞間空隙

7、加大,連接松散,活細(xì)胞數(shù)量明顯降低,懸浮細(xì)胞明顯增多,以通高氧48h最明顯。(2)免疫熒光雙染結(jié)果顯示:小窩蛋白-1免疫熒光陽性細(xì)胞呈紅色熒光,TGF-β1免疫熒光陽性細(xì)胞呈綠色熒光,兩者合成顯示黃色熒光。在對(duì)照組,小窩蛋白-1的高表達(dá)伴隨著TGF-β1的低表達(dá)(44.25±3.23 vs10.18±2.74)；在實(shí)驗(yàn)組,隨著通氧時(shí)間的延長,小窩蛋白-1表達(dá)逐漸減弱,TGF-β1表達(dá)逐漸增強(qiáng)(12h:35.25±1.88 vs17.32

8、±1.50；24h:20.75±1.68 vs26.51±1.82；48h:9.86±2.80 vs41.94±4.47)。相同時(shí)間點(diǎn)小窩蛋白-1的陽性表達(dá)與TGF-β1的陽性表達(dá)有負(fù)相關(guān),以對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組48h最顯著(r=-0.91,-0.62,-0.53,-0.88,P<0.05)。
　　 結(jié)論:在高氧肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程中,Caveolin-1表達(dá)顯著性減少,TGF-β1表達(dá)持續(xù)性增多,兩者呈拮抗關(guān)系,提示Caveolin