博萊霉素與肺炎雙球菌致大鼠肺損傷過程中TGF-β-,1-和VEGF表達的比較研究.pdf

1、本研究為探討博萊霉素致肺損傷后肺纖維化形成的機理、并尋找其可能的治療策略，用免疫組織化學(xué)和電鏡觀察方法動態(tài)檢測了博萊霉素與肺炎雙球菌致大鼠肺損傷過程中TGF-β1和VEGF表達的差異以及青霉素的干預(yù)作用，以期闡明PF形成的分子機制、從而為制定PF早期診治的策略提供新的思路。 研究方法：以健康SD雄性大鼠150只(由本校實驗動物中心提供)，體重180～210g，隨機分為5組(BLM組、BLM+P組、PMDC組、PMDC+P組及對照

2、組)，每組各30只。 BLM與PMDC致大鼠肺損傷和肺炎模型的制作：用10mg.ml-1戊巴比妥鈉0.5ml腹腔麻醉大鼠，手術(shù)暴露氣管，用1ml注射器抽取含博萊霉素-A5(5mg.kg-1，用生理鹽水配成4g.L-1溶液)溶液，經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端刺入氣管，將藥液注入氣管；PMDC組同法經(jīng)氣管穿刺后每只大鼠注入肺炎雙球菌液0.2ml(CFU3×108/ml)。BLM+P組和PMDC+P組大鼠在進行上述處理后第3d開始給予青霉

3、素(40萬U/只/d)治療，連續(xù)給藥4d至第7d結(jié)束。對照組在相同條件下氣管內(nèi)注入相同數(shù)量的生理鹽水，方法同BLM模型組。PMDC組動物分別于3和7d隨機處死6只、14和28d各處死9只，其余四組動物分別于7、14和28d各隨機處死10只。取左全肺，分別行肺組織標本HE染色和透射電鏡、TGF-β1及VEGF免疫組織化學(xué)染色；用圖像分析系統(tǒng)對其肺組織中VEGF和TGF-β1進行定性、定量分析。 研究結(jié)果： 1、病理組織學(xué)觀

4、察：對照組肺泡及肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常。肺炎雙球菌(PMDC)組3d時可見肺泡壁水腫，肺泡腔內(nèi)出血明顯，肺泡腔內(nèi)巨噬細胞增多，并出現(xiàn)中性粒細胞和嗜酸性粒細胞等炎性細胞浸潤。7d時PMDC組出現(xiàn)典型的細菌性肺炎癥狀，表現(xiàn)為肺泡和間質(zhì)的滲出增多，部分區(qū)域出現(xiàn)實變；14d時上述癥狀有所減輕，28d時除仍有少量實變區(qū)外，大部分肺組織恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。PMDC+P組在第7d時肺泡炎的癥狀即明顯減輕，至第14和28天時基本恢復(fù)正常。BLM組和BLM+P組的光鏡

5、改變相似，7d時兩組動物肺泡間隔有明顯的水腫，肺泡萎陷、毛細血管增多，間質(zhì)內(nèi)巨噬細胞和淋巴細胞增多；14d時仍為肺泡炎表現(xiàn)；28d時肺間質(zhì)成纖維細胞增多，膠原纖維呈索條狀沉積于毛細血管周圍，肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺泡腔消失。 2、透射電鏡觀察：對照組肺泡上皮和血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)較完整，細胞內(nèi)可見少量吞飲小泡，基底膜呈連續(xù)線狀。7d時PMDC組肺泡腔內(nèi)仍可見肺炎雙球菌，肺泡Ⅱ型上皮細胞變性壞死，基膜不清。28d時仍有少量肺組織肺泡腔擴張，間隔部

6、分斷裂，毛細血管內(nèi)皮、基膜完整。PMDC+P組第7d時肺內(nèi)支氣管上皮細胞增生、部分肺泡腔出血，Ⅱ型細胞增生；28d時毛細血管內(nèi)皮、基膜完整，Ⅱ型細胞形態(tài)完整，間質(zhì)膠原纖維正常。7d時BLM+P組肺泡Ⅰ型上皮細胞脫落明顯，細胞連接不清；間質(zhì)膠原纖維和彈性纖維多，肺泡腔有明顯出血、滲出，并伴有大量纖維素滲出和膿液；28d時以肺泡壁增厚、膠原纖維、彈性纖維和成纖維細胞增多為主要特征，并有大量Ⅱ型肺泡上皮細胞增生，此時肺纖維化已經(jīng)形成，較多肺泡

7、結(jié)構(gòu)已破壞，纖維組織增生明顯。 3、免疫組織化學(xué)染色及定量分析：對照組大鼠肺內(nèi)VEGF主要定位于Ⅱ型肺泡上皮細胞、細支氣管上皮細胞、血管壁平滑肌細胞、肺泡巨噬細胞和間質(zhì)細胞。PMDC組3d時可見肺間質(zhì)血管內(nèi)皮細胞、支氣管上皮細胞VEGF表達增加，肺泡巨噬細胞、嗜酸性粒細胞也有表達。7d時PMDC、BLM和BLM+P組大鼠肺內(nèi)間質(zhì)細胞、肺泡上皮細胞的VEGF免疫反應(yīng)陽性區(qū)面積比值均顯著高于對照組(P＜0.05)；BLM+P組肺內(nèi)間

8、質(zhì)細胞、肺泡上皮細胞的VEGF陽性區(qū)面積比值明顯高于PMDC+P組(P＜0.05)。14d時PMDC和PMDC+P組肺內(nèi)間質(zhì)細胞、支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞中VEGF的表達量與對照組均無顯著差異(P＞0.05)；而BLM和BLM+P組肺泡上皮細胞、肺內(nèi)間質(zhì)細胞和支氣管上皮細胞中VEGF免疫反應(yīng)陽性區(qū)面積比值顯著高于對照組和PMDC+P(P＜0.01)。28d時，PMDC和PMDC+P組肺內(nèi)間質(zhì)細胞、支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞中VEG

9、F的表達水平已與對照組相同；BLM和BLM+P組肺內(nèi)3種成分中VEGF的表達量仍顯著高于對照組(P＜0.01)和PMDC+P組(P＜0.05)。對照組TGF-β1免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)主要定位和分布于肺泡和間質(zhì)內(nèi)的巨噬細胞，少量陽性細胞位于細支氣管和肺間質(zhì)血管周圍。7d時實驗各組肺內(nèi)TGF-β1免疫反應(yīng)陽性巨噬細胞數(shù)均顯著高于對照組(P＜0.05)，而BLM+P組和PMDC+P組之間差異不明顯(P＞0.05)。14d時BLM組和BLM+P組肺

10、泡及間質(zhì)中TGF-β1免疫反應(yīng)陽性巨噬細胞比分比繼續(xù)升高、與對照組和PMDC+P組相差顯著(P＜0.01；P＜0.05)；而PMDC+P組TGF-β1陽性巨噬細胞數(shù)與對照組無顯著差別(P＞0.05)。28d時BLM組和BLM+P組肺泡及間質(zhì)中TGF-β1免疫反應(yīng)陽性巨噬細胞比率仍維持在14d時的水平、與對照組和PMDC+P組相差顯著(P＜0.01)。 研究結(jié)論： 1、VEGF持續(xù)高表達與大鼠血管內(nèi)皮細胞損傷有關(guān)，而血管內(nèi)

11、皮細胞的損傷可能是BLM誘發(fā)大鼠肺纖維化的重要啟動因素和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 2、TGF-β1在BLM肺損傷和PMDC肺炎早期肺內(nèi)巨噬細胞中均出現(xiàn)高表達，BLM肺損傷過程中TGF-β1的持續(xù)高表達，而PMDC肺炎的中后期TGF-β1的表達接近正常水平。TGF-β1的持續(xù)高表達可能與血管損傷修復(fù)及血管新生密切相關(guān)。 3、BLM與肺炎雙球菌所致肺損傷的分子機制不同。即前者導(dǎo)致的肺損傷是不可逆的，伴有TGF-β1和VEGF的持續(xù)高表達；