阿魏酸的降解作用規(guī)律和機(jī)理研究及其在藥物質(zhì)量控制中的應(yīng)用.pdf

1、中醫(yī)藥是中華民族燦爛文明中重要的組成部分之一，經(jīng)過(guò)于百年的使用，其功能和療效已經(jīng)得到人們的普遍認(rèn)同。目前臨床上中藥的應(yīng)用日益廣泛，新品種、新劑型也不斷涌現(xiàn)，然而近年來(lái)中藥不良反應(yīng)的報(bào)道逐年增多，甚至某些復(fù)方中藥制劑還造成了嚴(yán)重的不良后果。這些問(wèn)題主要起源于中藥（特別是植物藥）化學(xué)成分復(fù)雜，很難對(duì)其未知成分--加以控制；即使是已知活性的指標(biāo)成分，也不乏穩(wěn)定性較差的種類，例如虎杖、大黃等藥材的成分白藜蘆醇及其苷在物理及化學(xué)因素的誘導(dǎo)下發(fā)生幾

2、何異構(gòu)現(xiàn)象。因此，不穩(wěn)定成分降解作用的規(guī)律和機(jī)理探討，降解產(chǎn)物的毒性和代謝參數(shù)研究，乃至含有不穩(wěn)定成分的品種或制劑的上市后再評(píng)價(jià)將在有效地控制藥物質(zhì)量、保證藥品的安全性和有效性方面具有重要意義。
　　 本課題以阿魏酸作為這類成分的代表物，它具有抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、清除自由基等作用，常常作為多種中藥制劑的有效或指標(biāo)成分，用于評(píng)價(jià)和控制其藥物的質(zhì)量；其鈉鹽（阿魏酸鈉）具有抗腫瘤、抗肝纖維化及治療心、腦血管疾病等藥理作用，并在臨床上得到

3、了廣泛的使用。而最近有研究表明阿魏酸以溶液狀態(tài)存在時(shí)性質(zhì)不穩(wěn)定，容易受外界和溶液環(huán)境等因素的影響。在臨床使用中，阿魏酸還曾引起了過(guò)敏反應(yīng)，因此，其穩(wěn)定性受到人們?cè)絹?lái)越多的重視和關(guān)注。本課題選取阿魏酸作為研究對(duì)象，為含有這類成分的質(zhì)量研究提供新的方法和思路。
　　 本研究采用了現(xiàn)代分析手段（LC、DAD、MS、1H-NMR）和分離技術(shù)（固相萃取、制備液相），對(duì)阿魏酸降解作用進(jìn)行了考察研究，從而為該類藥物的穩(wěn)定性試驗(yàn)和研究提供了手段

4、和理論依據(jù)。研究結(jié)果表明：（1）建立分析測(cè)定阿魏酸的液相色譜分析方法，通過(guò)研究比較溫度、光線、濃度、溶液pH等因素對(duì)阿魏酸穩(wěn)定性的影響，表明阿魏酸受光線條件影響顯著，其水溶液對(duì)光線較為敏感；（2）阿魏酸溶液置于強(qiáng)光下照射，采用柱色譜和制備液相色譜法分離得到光降解產(chǎn)物，經(jīng)DAD、MS、1H-NMR鑒定后確定其光降解產(chǎn)物為順式阿魏酸；（3）采用液相色譜分析方法以外標(biāo)法同時(shí)測(cè)定反式和順式阿魏酸的濃度，研究阿魏酸的光致順?lè)串悩?gòu)化反應(yīng)屬于1-1級(jí)

5、對(duì)峙反應(yīng)，測(cè)定4℃、23℃、40℃、60℃下的反應(yīng)速率常數(shù)，得到正、逆向反應(yīng)的活化能分別為20.51KJ·mol-1，35.68KJ·mol-1；（4）以口服給藥和靜脈注射兩種方式，按《中國(guó)藥典》2005版二部附錄ⅪC方法，分別給予兩組小鼠已達(dá)到平衡時(shí)的順、反阿魏酸混合溶液（其中反式阿魏酸相當(dāng)于注射劑的半數(shù)致死量），初步證實(shí)其未見急性毒性反應(yīng)，但是否會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)期毒性或其它毒副作用還有待于進(jìn)一步研究；（5）本文采用中空纖維離心超濾法測(cè)得的反

6、式阿魏酸的血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定結(jié)果與采用平衡透析法的結(jié)果一致。在同時(shí)研究順、反式兩種阿魏酸時(shí)，反式、順式阿魏酸與血漿蛋白結(jié)合率為23.8％和31.0％，測(cè)定結(jié)果區(qū)別來(lái)自兩者本身的極性差異。
　　 一、阿魏酸降解作用規(guī)律研究及機(jī)理探討
　　 （一）阿魏酸與降解產(chǎn)物的分析方法及其穩(wěn)定性影響因素的研究
　　 目的：考察比較溫度、光線、濃度、溶液pH等因素對(duì)阿魏酸穩(wěn)定性的影響，研究確定阿魏酸降解作用的主要因素。
　　

7、 方法：建立高效液相色譜法（HPLC）分離分析阿魏酸及其降解產(chǎn)物，采用Hypersil ODS C18色譜柱（4.6mm×150mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇：乙腈：1％冰醋酸（15：10：75）；流速：1.0ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；柱溫：室溫。測(cè)定阿魏酸的剩余濃度，擬合動(dòng)力學(xué)方程并計(jì)算降解速率。
　　 結(jié)果：阿魏酸在8.00～1.02×103μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，阿魏酸的方法回收率不低于99.5％

8、；測(cè)定不同濃度阿魏酸的剩余濃度，以其均值與時(shí)間按零級(jí)、一級(jí)、二級(jí)化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式進(jìn)行曲線擬合均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)；阿魏酸在pH值趨于中性時(shí)穩(wěn)定性較好，在酸性環(huán)境下次之，堿性環(huán)境中最差；阿魏酸降解速率常數(shù)隨溫度升高而增大，但總體上速率常數(shù)均較??；降解速率常數(shù)與光照強(qiáng)度成正比，但在避光條件下其降解率很低。
　　 結(jié)論：HPLC測(cè)定阿魏酸的含量方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確；比較濃度、pH、溫度和光強(qiáng)度等影響因素，阿魏酸對(duì)光線敏感.光是影響

9、其穩(wěn)定性的主要因素。
　　 （二）阿魏酸主要降解產(chǎn)物的分離、鑒定及性質(zhì)研究
　　 目的：確定阿魏酸的主要降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，并研究其性質(zhì)。
　　 方法：光強(qiáng)化條件下制備阿魏酸降解產(chǎn)物，采用柱色譜和制備液相色譜分離其產(chǎn)物，經(jīng)DAD、MS、1H-NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
　　 結(jié)果：液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定結(jié)果表明其降解產(chǎn)物具有與阿魏酸相同的m/z，均為193；由1H-NMR圖譜上H的δ推斷其降解產(chǎn)物為順式阿魏酸；LC-DAD提

10、供的紫外色譜圖顯示降解產(chǎn)物的吸收帶發(fā)生藍(lán)移，為其鑒定結(jié)構(gòu)提供了依據(jù)。
　　 結(jié)論：阿魏酸光降解后制備得到黃色油狀液體，經(jīng)鑒定認(rèn)為它是阿魏酸的順式異構(gòu)體。
　　 （三）阿魏酸光轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)研究及光致異構(gòu)化規(guī)律和機(jī)理探討
　　 目的：研究光照條件下阿魏酸轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)規(guī)律，揭示阿魏酸光致異構(gòu)化作用的機(jī)理
　　 方法：按第一部分“色譜條件”的HPLC分析方法，同時(shí)測(cè)定溶液中反式和順式阿魏酸含量，求出該轉(zhuǎn)化反應(yīng)正向、逆

11、向反應(yīng)速率常數(shù)，計(jì)算反應(yīng)平衡常數(shù)并代入阿侖尼烏斯（Arrlenius）經(jīng)驗(yàn)公式求出正、逆向反應(yīng)活化能。
　　 結(jié)果：經(jīng)擬合阿魏酸光致異構(gòu)化反應(yīng)的兩個(gè)方向都能夠發(fā)生且均符合一級(jí)反應(yīng)，此反應(yīng)屬于1-1級(jí)對(duì)峙反應(yīng)；采用外標(biāo)法分別測(cè)定23℃時(shí)阿魏酸溶液中兩種物質(zhì)的濃度，并計(jì)算出正、逆向反應(yīng)速率常數(shù)分別為1.569×10-4（μs）-1和1.590×104（μs）-1；正、逆向反應(yīng)的活化能分別為20.51kJ·mol-1和35.68kJ·

12、mol-1；在光照條件下，這一反應(yīng)需要經(jīng)過(guò)一個(gè)中間過(guò)渡態(tài)進(jìn)而發(fā)生順?lè)串悩?gòu)轉(zhuǎn)化的。
　　 結(jié)論：通過(guò)測(cè)定阿魏酸光致異構(gòu)化過(guò)程中反式和順式阿魏酸含量，計(jì)算出該反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)（光致異構(gòu)化速率常數(shù)、平衡常數(shù)和活化能），研究得出了阿魏酸光致異構(gòu)化的規(guī)律和作用機(jī)理。
　　 二、順式阿魏酸異常毒性及蛋白結(jié)合率的初步研究
　　 （一）順式阿魏酸的異常毒性研究
　　 目的：阿魏酸鈉制劑中存在降解產(chǎn)物順式阿魏酸時(shí)，考察其急

13、性毒性反應(yīng)。
　　 方法：以口服給藥和靜脈注射兩種方式按《中國(guó)藥典》2005版二部附錄ⅪC方法進(jìn)行異常毒性試驗(yàn)，觀察兩組各10只小鼠的即時(shí)反應(yīng)，仍按正常條件飼養(yǎng)一周，并分別觀察和記錄它們的毒性反應(yīng)。
　　 結(jié)果：以灌胃和尾靜脈注射兩種方式給藥后，觀察小鼠一周內(nèi)反應(yīng)，記錄下每組10只小鼠的各自的即時(shí)反應(yīng)，在一周內(nèi)兩組小鼠均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。
　　 結(jié)論：分別給予兩組小鼠已達(dá)到平衡時(shí)的順、反阿魏酸混合溶液（其中反式阿魏

14、酸相當(dāng)于注射劑的半數(shù)致死量），均未見出現(xiàn)急性毒性反應(yīng)，初步認(rèn)為有降解產(chǎn)物順式阿魏酸存在時(shí)未見明顯異常毒性，但其是否會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)期毒性或其他毒副作用還有待于進(jìn)一步考察。
　　 （二）中空纖維離心超濾法測(cè)定順、反式阿魏酸與大鼠血漿的蛋白結(jié)合率
　　 目的：測(cè)定順、反式阿魏酸的大鼠血漿蛋白結(jié)合率，比較兩種異構(gòu)體在體內(nèi)特征上的異同，并建立適用于不穩(wěn)定藥物血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定方法。
　　 方法：建立HPLC測(cè)定血漿中阿魏酸兩種

15、異構(gòu)體的分析方法，采用Hypersil ODS C18色譜柱（4.6mm×150mm，5μm），（大連依利特科學(xué)儀器有限公司）；流動(dòng)相為甲醇：乙腈：1％冰醋酸（12：10：78）；流速：1.0 ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；柱溫：室溫。利用中空纖維離心超濾法分別測(cè)定阿魏酸的兩種異構(gòu)體在血漿中游離濃度，計(jì)算兩者血漿蛋白結(jié)合率。
　　 結(jié)果：血漿中反式與順式阿魏酸分別在4.00×10-2～2.56μg.mL-1、3.10

16、×10-2～1.94μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；反式與順式阿魏酸的回收率不低于95.1％和94.1％；單獨(dú)研究反式阿魏酸，它在大鼠血漿中的蛋白結(jié)合率為24.3％，順、反阿魏酸同時(shí)研究時(shí)，反式及順式阿魏酸與血漿蛋白結(jié)合率為23.8％和31.0％，測(cè)定結(jié)果微小的差異來(lái)自兩者本身的極性，經(jīng)t檢驗(yàn)表明，順、反式阿魏酸的蛋白結(jié)合率差異并不顯著。
　　 結(jié)論：本文采用中空纖維離心超濾法測(cè)得的反式阿魏酸的血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定結(jié)果與采用平衡