高壓氧預(yù)適應(yīng)對(duì)小鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型的保護(hù)作用研究.pdf

1、背景
　　腦血管疾病是當(dāng)今世界上死亡率最高的三大疾病之一,缺血性腦血管病約占腦血管疾病總數(shù)的85％以上,同時(shí)腦缺血也會(huì)在許多臨床疾病診治過(guò)程出現(xiàn),如何提高腦組織的缺血耐受程度,減輕缺血后的神經(jīng)功能損傷,一直是神經(jīng)外科致力研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。我們課題組前期研究表明,高壓氧預(yù)適應(yīng)(hyperbaricoxygenpreconditioning,HBOP)對(duì)腦缺血和脊髓損傷具有保護(hù)作用,并且文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)HBOP可以誘導(dǎo)心臟、肝臟、腎臟、脊髓及

2、腦組織的缺血耐受,但具體作用機(jī)制仍不清楚。
　　P2X7受體是ATP門(mén)控的離子通道P2X受體家族中一個(gè)獨(dú)特的亞型,在腦組織內(nèi)廣泛分布,在缺血性腦損傷中處于較上游的調(diào)節(jié)位點(diǎn)。腦缺血后,P2X7受體活化,可導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡、髓磷脂損傷,引起腦白質(zhì)的損傷;同時(shí),P2X7受體可以活化小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞,促進(jìn)IL-1β、TNF-α等炎性因子的釋放,引起組織壞死和凋亡。AQP4是腦組織中表達(dá)最多的水通道蛋白(Aquaporins,A

3、QPs),在維持機(jī)體的水平衡和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中起重要作用。腦缺血后,AQP4參與早期細(xì)胞性腦水腫的發(fā)生發(fā)展,并且通過(guò)參與調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能,影響離子及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)。
　　我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)HBOP具有缺血腦保護(hù)作用,并且可以調(diào)節(jié)脊髓損傷后P2X7受體的表達(dá),文獻(xiàn)表明應(yīng)用P2X7受體抑制劑BBG后,AQP4的表達(dá)水平減弱,并且P2X7受體及AQP4與缺血性腦損傷關(guān)系密切。因此我們提出HBOP的缺血腦保護(hù)作用可能與

4、其對(duì)P2X7受體及AQP4的調(diào)節(jié)有關(guān)。本課題在經(jīng)典Longa法基礎(chǔ)上加以改良,建立小鼠的線栓法永久性大腦中動(dòng)脈閉塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)模型,并以此模型為基礎(chǔ)探討HBOP對(duì)小鼠永久性MCAO模型的缺血腦保護(hù)作用及其機(jī)制,為HBOP的臨床應(yīng)用提供新的思路和方向。
　　方法:健康成年雄性C57BL/6小鼠,分成假手術(shù)對(duì)照組(Control+sham)、高壓氧預(yù)適應(yīng)假手術(shù)組(HBOP+s

5、ham)、MCAO對(duì)照組(Control+MCAO)、高壓氧預(yù)適應(yīng)MCAO組
　　(HBOP+MCAO)4個(gè)組,采用改良Longa法建立線栓法永久性大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型。按高壓氧預(yù)適應(yīng)方案(100%O2,2.5ATA,2h/d)進(jìn)行連續(xù)5天預(yù)適應(yīng),
　　HBOP+MCAO及HBOP+sham組在最后一次預(yù)適應(yīng)后24h進(jìn)行MCAO建模。MCAO建模后24h,觀察各組神經(jīng)功能損傷情況、梗塞灶大小、腦含水量及組織損傷程度

6、。
　　結(jié)果:HBOP能明顯降低小鼠永久性MCAO模型的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分,縮小梗塞灶體積,減輕組織損傷程度。
　　結(jié)論:HBOP對(duì)小鼠永久性MCAO模型具有保護(hù)作用。
　　方法:健康成年雄性C57BL/6小鼠,分成假手術(shù)對(duì)照組(Control+sham)、高壓氧預(yù)適應(yīng)假手術(shù)組(HBOP+sham)、MCAO對(duì)照組(Control+MCAO)、高壓氧預(yù)適應(yīng)MCAO組
　　(HBOP+MCAO)4個(gè)組,采用改良Long

7、a法建立線栓法永久性大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型。按高壓氧預(yù)適應(yīng)方案(100%O2,2.5ATA,2h/d)進(jìn)行連續(xù)5天預(yù)適應(yīng),
　　HBOP+MCAO及HBOP+sham組在最后一次預(yù)適應(yīng)后24h進(jìn)行MCAO建模。MCAO建模后24h,觀察各組神經(jīng)功能損傷情況、梗塞灶大小、腦含水量及組織損傷程度。
　　結(jié)果:HBOP能明顯降低小鼠永久性MCAO模型的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分,縮小梗塞灶體積,減輕組織損傷程度。
　　結(jié)論:HB

8、OP對(duì)小鼠永久性MCAO模型具有保護(hù)作用。
　　第二部分:HBOP對(duì)小鼠永久性MCAO模型腦組織中P2X7受體及AQP4表達(dá)的影響
　　目的:觀察HBOP對(duì)小鼠永久性MCAO模型腦組織中P2X7受體和AQP4表達(dá)的影響。
　　方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組情況、高壓氧預(yù)適應(yīng)方案及MCAO模型建立均與第一部分相同,通過(guò)WesternBlot及RT-QPCR法檢測(cè)MCAO建模后6h、12h、24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組小鼠腦內(nèi)P2X7受體及

9、AQP4的蛋白表達(dá)及mRNA轉(zhuǎn)錄情況。
　　結(jié)果:
　　1.WesternBlot結(jié)果提示:HBOP可以升高小鼠正常腦組織內(nèi)的P2X7受體及AQP4蛋白水平的表達(dá);提前MCAO后P2X7受體及AQP4蛋白表達(dá)的峰值,MCAO建模后24h點(diǎn)HBOP+MCAO組P2X7受體及AQP4的蛋白表達(dá)低于Control+MCAO組。
　　2.RT-QPCR結(jié)果提示:HBOP可以提高正常腦組織中內(nèi)P2X7受體及AQP4的mRNA轉(zhuǎn)錄

10、水平。在MCAO建模后,HBOP+MCAO組P2X7受體與AQP4轉(zhuǎn)錄趨勢(shì)與
　　Control+MCAO組基本相同,但變化幅度小于MCAO組。
　　結(jié)論:HBOP對(duì)腦內(nèi)P2X7受體及AQP4具有調(diào)節(jié)作用。
　　第三部分:P2X7受體及AQP4在HBOP對(duì)小鼠永久性MCAO模型保護(hù)作用中的機(jī)制研究
　　目的:利用P2X7受體激動(dòng)劑BzATP對(duì)HBOP后小鼠永久性MCAO模型進(jìn)行干預(yù),探討HBOP對(duì)小鼠永久性MCA

11、O模型保護(hù)作用的機(jī)制。
　　方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情況同第一部分,小鼠分為HBOP假手術(shù)組(HBOP+sham)、BzATP干預(yù)HBOP假手術(shù)組(BzATP+HBOP+sham)、HBOP+MCAO組(HBOP+MCAO)、BzATP干預(yù)HBOPMCAO組(BzATP+HBOP+MCAO)4個(gè)組。HBOP方案及MCAO建模方法同前。在建模后10min按1mg/kgBzATP行側(cè)腦室注射。MCAO建模后24h,觀察各組神經(jīng)功能損傷情況、梗塞

12、灶大小、腦含水量及組織損傷程度,并進(jìn)行WesternBlot及RT-QPCR檢測(cè)P2X7受體及AQP4的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:P2X7受體激動(dòng)劑BzATP可以增加P2X7受體和AQP4的蛋白表達(dá)及mRNA轉(zhuǎn)錄水平,提高HBOP小鼠的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分,增大梗塞灶體積,加重組織損傷程度,拮抗HBOP對(duì)小鼠永久性MCAO模型的保護(hù)作用。
　　結(jié)論:
　　1.P2X7受體對(duì)AQP4表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用;
　　2.HBOP可能通