RNA干擾誘導(dǎo)CD147基因沉默穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的研究.pdf

1、背景：
　　 目前認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)斑塊表面破裂形成血栓和動(dòng)脈閉塞是引起急性冠脈綜合征(AcuteCoronarySyndromes，ACS)的主要病理基礎(chǔ)和發(fā)病機(jī)制，而AS斑塊從穩(wěn)定變?yōu)橐讚p的過(guò)程涉及到炎癥、免疫、代謝、凝血等多個(gè)環(huán)節(jié)，其中AS斑塊內(nèi)覆蓋脂質(zhì)中心的纖維帽厚度、強(qiáng)度及其膠原組織含量的多少是決定斑塊穩(wěn)定與否至關(guān)重要的因素。纖維帽的重要成分為細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular

2、Matrix，ECM)，其主要成分為纖維結(jié)構(gòu)蛋白、蛋白多糖等。纖維帽越厚，膠原纖維含量越多，斑塊越不容易破裂。因此，纖維帽的破裂與纖維帽ECM含量的減少密切相關(guān)。基質(zhì)金屬蛋白酶(MatrixMetalloproteinase，MMPs)是降解ECM最重要的酶類，通過(guò)降解ECM，使AS斑塊由“穩(wěn)定斑塊”向“不穩(wěn)定斑塊”轉(zhuǎn)變，從而誘發(fā)斑塊破裂，導(dǎo)致急性冠脈綜合征。
　　 CD147分子在人體內(nèi)的命名為細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(E

3、xtracellularMatrixMetalloproteinaseInducer,EMMPRIN)，又稱為basigin、M6、Neurothelin，早期是從肺癌細(xì)胞系LX-1中被分離出來(lái)，是一種高度糖基化的、廣泛表達(dá)于造血及非造血細(xì)胞系的跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員。研究發(fā)現(xiàn)CD147可以在平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞等多種細(xì)胞中誘導(dǎo)金屬基質(zhì)蛋白酶的產(chǎn)生，其包括MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、1型跨膜基

4、質(zhì)金屬蛋白酶蛋白(MembraneType1MatrixMetalloproteinase，MT-MMP)等，由此我們推測(cè)斑塊內(nèi)CD147通過(guò)影響MMPs的表達(dá)，對(duì)斑塊穩(wěn)定性可能起到重要作用。
　　 RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是指將外源性或內(nèi)源性的dsRNA(doublestrandedRNA，dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞后，引起與其同源的mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致基因不表達(dá)，由于dsRNA可以抑制不同類型

5、的靶向基因表達(dá)，因此RNAi技術(shù)也被形象地稱為基因敲除(knockout)或基因沉默(genesilencing)。RNAi技術(shù)是目前簡(jiǎn)單而高效阻斷哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)特異基因表達(dá)的最有效方法，因?yàn)榘l(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，所以又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PostTranscriptionalGeneSilencing，PTGS)。但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)RNAi的作用不僅是在轉(zhuǎn)錄后水平，在轉(zhuǎn)錄和翻譯等多個(gè)不同的水平也能實(shí)現(xiàn)。dsRNA在體內(nèi)引起RNA干擾

6、的過(guò)程大致可以分為以下2個(gè)階段:長(zhǎng)鏈的dsRNA被Dicer(一種具有人1RnaseⅢ樣活性的核酸酶)識(shí)別并加工成具有21-23個(gè)核苷酸的小干擾RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)，隨后這些雙鏈siRNA結(jié)合到1種蛋白復(fù)合物中形成RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingproteincomplex，RISC）;RISC中的螺旋酶解開雙鏈siRNA，后者通過(guò)解開的反義鏈與和siRNA具有高

7、度互補(bǔ)序列的mRNA結(jié)合，并引導(dǎo)siRNA結(jié)合mRNA。隨后siRNA與mRNA在復(fù)合體中換位，核酸酶Dicer將mRNA切割成21-23個(gè)核苷酸的片段，特異性地抑制靶基因的表達(dá)。而新產(chǎn)生的雙鏈RNA片段可再次形成RISC復(fù)合物，繼續(xù)降解mRNA，從而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，因此，每個(gè)細(xì)胞只需要幾個(gè)siRNA分子就可以引起強(qiáng)烈的RNAi效應(yīng)。
　　 目前盡管已成功應(yīng)用許多措施防治或減少冠心病的發(fā)生發(fā)展，如溶栓、降脂等療法，但對(duì)于易損或

8、破裂斑塊的防治作用仍然很有限，如何穩(wěn)定易損斑塊依舊是目前ACS防治的瓶頸與難點(diǎn)。近年來(lái)，隨著RNAi技術(shù)在心血管病方面已表現(xiàn)出傳統(tǒng)治療方法所無(wú)法比擬的優(yōu)越性，人們認(rèn)識(shí)到能否通過(guò)RNAi技術(shù)來(lái)穩(wěn)定動(dòng)脈硬化斑塊，為心血管疾病的治療開辟了新途徑。而隨著動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊機(jī)制的研究深入，發(fā)現(xiàn)MMPs及CD147分子在AS不穩(wěn)定斑塊的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，抑制MMPs和CD147表達(dá)和活性升高能否成為穩(wěn)定斑塊，防止冠狀動(dòng)脈事件的治療策略的新靶

9、點(diǎn)，而采用RNA干擾技術(shù)沉默相關(guān)基因更具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 第一部分，CD147慢病毒載體對(duì)兔外周血單核巨噬細(xì)胞的沉默作用
　　 目的：
　　 CD147在人體內(nèi)命名為細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子，通過(guò)影響平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞內(nèi)MMPs的表達(dá)，對(duì)斑塊穩(wěn)定性可能起到重要作用。通過(guò)設(shè)計(jì)、合成并構(gòu)建抑制CD147基因表達(dá)的短鏈RNA(shortinterferingRNA，shRNA)慢

10、病表達(dá)載體，并在體外篩選出能高效抑制兔外周血單核巨噬細(xì)胞中CD147表達(dá)的有效載體。
　　 方法：
　　 1、兔外周血單核細(xì)胞分離培養(yǎng)采集兔子動(dòng)脈肝素抗凝血(20U/ml全血)，加等量PBS液1:1比例稀釋混勻。在15ml離心管底部加入單核細(xì)胞分離液6ml，將肝素抗凝血與等量PBS液疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面，水平離心。用尖吸管緩慢插到第二層界面的云霧層，分離單個(gè)核細(xì)胞。加入5倍以上體積的預(yù)熱的PBS液，離心、

11、洗滌。末次離心后，棄上清，接種于50ml培養(yǎng)瓶，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后吸出培養(yǎng)基，用預(yù)熱的RPMI1640液清洗3遍，將未貼壁細(xì)胞洗脫，剩下的貼壁細(xì)胞即為單核細(xì)胞。
　　 2、誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞到巨噬細(xì)胞待上述細(xì)胞靜止12h后，換入含佛波酯的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，刺激48h使之轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞。
　　 3、實(shí)驗(yàn)分6組:①空白對(duì)照組:僅加入Polybrene2μl，不做任何處理;②NC對(duì)照組:加入NC慢病

12、毒載體0.1ml+Polybrene2μl;③慢病毒干擾組(A、B、C、D組):分別加入BSG-836、BSG-311、BSG-191、BSG-859慢病毒載體0.1ml+Polybrene2μl每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。
　　 4、72h后通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，并收集細(xì)胞和細(xì)胞上清液，分別行RT-PCR及ELISA檢測(cè)，觀察RNAi對(duì)CD147mRNA和蛋白表達(dá)的下調(diào)作用，并檢測(cè)細(xì)胞上清液中MMP-2、MMP-9蛋白的分泌情況。<

13、br>　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述與分析，計(jì)量資料用(x)±s（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，若總體方差齊時(shí)，多組樣本均數(shù)比較采用One-wayANOVA，多重比較應(yīng)用LSD法檢驗(yàn)?？傮w方差不齊時(shí)，采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)分析Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩兩組間比較應(yīng)用Dunnett'sT3法檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、RT-PCR檢測(cè)各組CD147

14、mRNA表達(dá)結(jié)果:各組均可檢測(cè)到CD147mRNA表達(dá)，組間存在顯著性差異(F=51.420，P=0.000)?？瞻讓?duì)照組、NC對(duì)照組的CD147mRNA表達(dá)水平無(wú)差異(P=0.796);慢病毒干擾各組(A-D組)mRNA表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組(P=0.000)，其中A組mRNA降低最為顯著，較空白對(duì)照組下調(diào)57.72％(P=0.000)
　　 2、ELISA檢測(cè)各組CD147蛋白表達(dá)及結(jié)果:各組均可檢測(cè)到CD147蛋白表達(dá)

15、，組間存在顯著性差異(F=18.423，P=0.000)。空白對(duì)照組、NC對(duì)照組CD147蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P=0.640)?？瞻讓?duì)照組及NC對(duì)照組CD147蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P=0.640)。慢病毒干擾組（A-D組）與空白對(duì)照組相比CD147蛋白表達(dá)量顯著降低(P值依次為P=0.000，P=0.000，P=0.001，P=0.000)，其中A組CD147蛋白表達(dá)降低最為顯著，較空白對(duì)照組下調(diào)42.40％(P=0.000)。

16、　　 3、各組MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá):各組均可檢測(cè)到MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)，組間均數(shù)有顯著性差異（分別為F=206.012，P=0.000;F=9.385，P=0.001）。各組間的多重比較，空白對(duì)照組、NC對(duì)照組、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量無(wú)顯著差異（分別為P=1.000;P=0.632）。慢病毒干擾組（A-D組）與空白對(duì)照組相比MMP-2、MMP-9表達(dá)量顯著降低，A組MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)與空白對(duì)照

17、組及NC對(duì)照組相比下降最明顯，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014，P=0.003)。
　　 4、單核/巨噬細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平與CD147水平的相關(guān)性各組MMP-2、MMP-9與CD147水平的相關(guān)系數(shù)分別為r=0.899，r=0.814，兩者與CD147表達(dá)水平存在顯著正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 結(jié)論：
　　 1、采用單個(gè)核細(xì)胞分離液密度梯度離心及吸附法成功分離出兔

18、外周血單核細(xì)胞。
　　 2、成功設(shè)計(jì)合成了針對(duì)CD147基因的shRNA慢病毒載體，并從中篩選出能特異且高效阻斷CD147表達(dá)的shRNA。
　　 第二部分，金屬基質(zhì)電白酶誘導(dǎo)因子(CD147)shRNA慢病毒載體穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化粥樣斑塊的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：
　　 1、利用液氮凍傷術(shù)結(jié)合高脂飲食喂養(yǎng)創(chuàng)建與人類斑塊相似的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型，為易損斑塊基礎(chǔ)研究及干預(yù)治療研究奠定基礎(chǔ)。
　　 2、

19、在上述自創(chuàng)的兔AS破裂斑塊模型基礎(chǔ)上，利用體外實(shí)驗(yàn)所篩選出能高效抑制兔外周血單核巨噬細(xì)胞中CD147表達(dá)的shRNA慢病毒表達(dá)載體，局部侵染兔頸動(dòng)脈粥樣斑塊，觀察并評(píng)價(jià)CD147RNAi穩(wěn)定易損斑塊的效果。
　　 方法：
　　 1、動(dòng)物模型的建立健康純種雄性新西蘭白兔30只，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，實(shí)施右頸總動(dòng)脈內(nèi)膜液氮凍傷術(shù)，術(shù)后高脂飼料喂養(yǎng)10周。
　　 2、局部慢病毒轉(zhuǎn)染液氮凍傷并高脂喂養(yǎng)10周后，隨機(jī)抽

20、取2只兔子處死，觀察斑塊情況。根據(jù)轉(zhuǎn)染病毒不同，隨機(jī)分為3組，各組分別命名:①空白對(duì)照組(n=8)頸動(dòng)脈斑塊處注射生理鹽水;②病毒陰性對(duì)照組(n=10)局部注射陰性對(duì)照慢病毒載體;③CD147慢病毒干擾組(n=10)于頸動(dòng)脈斑塊局部注射CD147慢病毒表達(dá)載體。并于轉(zhuǎn)染4周后，行液氮激發(fā)術(shù)，觀察斑塊破裂情況，檢測(cè)斑塊的病理學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　 3、分別于實(shí)驗(yàn)前、高脂飼養(yǎng)10周末、病毒干擾4周末及激發(fā)48h后采血，檢測(cè)血清總膽固醇(

21、TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)，并采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的水平。激發(fā)48h后處死所有動(dòng)物，取出實(shí)驗(yàn)血管作HE染色、Masson三色染色和彈力纖維染色，光鏡觀察斑塊形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。應(yīng)用NF-(K)、CD147、MMP-2、MMP-9及MMP-14的單克隆抗

22、體對(duì)實(shí)驗(yàn)血管進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，以明確斑塊處各炎性因子及金屬基質(zhì)蛋白酶系列蛋白表達(dá)情況。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述與分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩配對(duì)樣本均數(shù)總體比較時(shí)采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。干擾因素與時(shí)間主效應(yīng)和交互效應(yīng)的比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，多個(gè)樣本均數(shù)總體比較采用One-wayANOVA（方差不齊時(shí)多個(gè)樣本均數(shù)總體比較采用Brown-Forsythe法檢驗(yàn)，對(duì)自由度進(jìn)行校正

23、后在進(jìn)行比較）;方差齊時(shí)多個(gè)樣本均數(shù)間的多重比較采用LSD檢驗(yàn)（方差不齊時(shí)樣本均數(shù)間的多重比較采用Dunnett'sT3檢驗(yàn)），認(rèn)為P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、兔總體生長(zhǎng)良好。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共有5只兔死亡，實(shí)際用于結(jié)果分析的共23只。高脂喂養(yǎng)10周末，可見(jiàn)右側(cè)損傷段右側(cè)頸總動(dòng)脈形成明顯的粥樣斑塊。液氮凍傷結(jié)合高脂喂養(yǎng)10周后血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白3項(xiàng)指標(biāo)與造模前比較明顯升高（t值分

24、別為-42.117，-40.208，-30.293，P值均為0.000）。
　　 2、血清CD147濃度變化:實(shí)驗(yàn)前、造模后、慢病毒干擾4周末及液氮激發(fā)48h后，同組CD147在血清的表達(dá)具有顯著性差異(F=66.651，P=0.000)，同一時(shí)間點(diǎn)，各組兔CD147水平也存在顯著性差異(F=21.849，P=0.000)。時(shí)間與干擾因素存在交互效應(yīng)(F=6.474，P=0.000)。慢病毒干擾4周后，CD147干擾組CD147

25、水平較其它兩組明顯降低(P=0.000)。液氮激發(fā)后48h，空白對(duì)照組及NC對(duì)照組CD147水平較CD147干擾組明顯升高(P=0.000)。
　　 3、血清MMP-1濃度變化:實(shí)驗(yàn)前、造模后、慢病毒干擾4周末及液氮激發(fā)48h后MMP-1在血清的表達(dá)具有顯著性差異(F=17.695，P=0.000)，空白對(duì)照組、NC對(duì)照及CD147慢病毒組各組兔MMP-1水平也存在顯著性差異(F=21.849，P=0.000)，時(shí)間與干擾因素存

26、在交互效應(yīng)(F=7.407，P=0.000)。CD147慢病毒組兔的MMP-1濃度在造模后及液氮激發(fā)48h后較實(shí)驗(yàn)前明顯升高(P=0.000;P=0.012)，慢病毒干擾后與造模后相比MMP-1顯著降低(P=0.002)，與液氮激發(fā)48h后相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.314)。
　　 4、血清MMP-2濃度變化:實(shí)驗(yàn)前、造模后、慢病毒干擾4周末及液氮激發(fā)48h后MMP-2在血清的表達(dá)具有顯著性差異(F=66.787，P=0.0

27、00)，空白對(duì)照組、NC對(duì)照及CD147慢病毒組各組兔MMP-2水平也存在顯著性差異(F=15.233，P=0.000)，時(shí)間與分組存在交互效應(yīng)(F=7.971，P=0.000)。CD147慢病毒組兔的MMP-2濃度在造模后及液氮激發(fā)48h后明顯升高(P=0.000;P=0.012)，慢病毒干擾后與造模后相比MMP-2顯著降低(P=0.001)，與液氮激發(fā)48h后相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.415)。慢病毒干擾4周后及液氮激發(fā)48h后

28、，CD147干擾組MMP-2濃度較其他兩組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，P=0.000)。
　　 5、血清MMP-3濃度變化:實(shí)驗(yàn)前、造模后、慢病毒干擾4周末及液氮激發(fā)48h后MMP-3在血清的表達(dá)具有顯著性差異(F=61.345，P=0.000)，空白對(duì)照組、NC對(duì)照及CD147慢病毒組各組兔MMP-3水平也存在顯著性差異(F=8.901，P=0.000)，時(shí)間與分組存在交互效應(yīng)(F=8.202，P=0.000

29、)。CD147干擾組血清MMP-3水平造模后較實(shí)驗(yàn)前明顯升高(P=0.000);慢病毒干擾后4wMMP-3較造模后無(wú)明顯降低(P=0.481);液氮激發(fā)后48hMMP-3較干擾后4w無(wú)明顯升高(P=0.934)。液氮激發(fā)后48h，3組兔血清MMP-3水平存在顯著差異(F=16.980，P=0.000)空白對(duì)照組及NC對(duì)照組MMP-3濃度較CD147干擾組明顯升高(P=0.000)。
　　 6、血清MMP-9濃度變化:實(shí)驗(yàn)前、造模

30、后、慢病毒干擾4周末及液氮激發(fā)48h后CD147在血清的表達(dá)具有顯著性差異(F=28.399，P=0.000)，空白對(duì)照組、NC對(duì)照及CD147慢病毒組各組兔MMP-9水平也存在顯著性差異(F=123.432，P=0.000)，時(shí)間與分組存在交互效應(yīng)(F=13.609，P=0.000)。CD147干擾組血清MMP-9水平造模后較實(shí)驗(yàn)前明顯升高(P=0.000);慢病毒干擾后4wMMP-9較造模后明顯降低(P=0.004);液氮激發(fā)后48

31、hMMP-9較干擾后4w無(wú)明顯升高(P=0.661)。液氮激發(fā)48h后，CD147干擾組MMP-9水平較空白對(duì)照組低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 7、血清炎癥因子hs-CRP濃度水平的變化:實(shí)驗(yàn)前、造模后、慢病毒干擾4周末及液氮激發(fā)48h后hs-CRP在血清的表達(dá)具有顯著性差異(F=1604.86,P=0.000)，空白對(duì)照組、NC對(duì)照及CD147慢病毒組各組兔hs-CRP水平也存在顯著性差異(F=118.5

32、82，P=0.000)，時(shí)間與分組存在交互效應(yīng)(F=101.302，P=0.000)。CD147慢病毒組兔的hs-CRP濃度在造模后、病毒干擾后4周及液氮激發(fā)48h后明顯升高(P=0.000)，慢病毒干擾后與造模后相比hs-CRP無(wú)明顯升高(P=0.096)，與液氮激發(fā)48h后相比，后者明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。慢病毒干擾4周后，CD147干擾組hs-CRP濃度明顯低于其他兩組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)<