活性蘆薈口瘡緩釋藥膜對口腔潰瘍的臨床前實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　口腔潰瘍是口腔粘膜疾病中最常見的一種疾病，患病率為20％左右，是發(fā)生在口腔粘膜上的表淺性潰瘍，大小可從小米粒至黃豆大小、成圓形或卵圓形，潰瘍面為凹陷、周圍充血。潰瘍具有周期性、復(fù)發(fā)性及自限性等特點，好發(fā)于唇、頰、舌緣等。病因及致病機制仍不明確。誘因可能是局部創(chuàng)傷、精神緊張、食物、藥物、激素水平改變及維生素或微量元素缺乏等。系統(tǒng)性疾病、遺傳、免疫及微生物在其發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用。治療主張全身和局部、中醫(yī)和西醫(yī)、

2、生理和心理相結(jié)合。近年來國內(nèi)外已報道多種治療方法，但以局部治療為主。局部治療適合于健康的RAU患者。以消炎、止痛、防止繼發(fā)感染、促進愈合為原則。局部皮質(zhì)類固醇是目前世界各國治療RAU最常用的方法，可減少RAU的癥狀，但在減少潰瘍復(fù)發(fā)方面幾乎無作用?？咕惢驓⒕悺⒑?、藥膏、霜劑、藥膜給藥又減輕癥狀，促進愈合的作用。目前尚無較為理想的治療藥物，不能滿足患者的治療需求。
　　活性蘆薈口瘡緩釋藥膜采用理化性質(zhì)穩(wěn)定、親水性大、透氣性強

3、的材料作為成膜材料，利用蘆薈的抗?jié)冃?，直接作用于口腔粘膜、皮膚等部位。膜劑加強了藥物與粘膜接觸的緊密性及持續(xù)性，既可對粘膜起機械保護作用（保護潰瘍面），又有利于藥物的吸收、延長藥物在患病局部的作用時間，且有定位、定向釋放作用、局部藥物濃度高、攜帶使用方便等優(yōu)點。因此利用中藥活性蘆薈和西藥達克羅寧配伍制成活性蘆薈口瘡緩釋藥膜，為口腔潰瘍患者提供較理想的治療藥物。根據(jù)國家的相關(guān)政策法規(guī)，按照國家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的《新藥審批辦法》中有關(guān)中

4、藥制劑的規(guī)定及《中藥新藥研究的技術(shù)要求》，進行新藥活性蘆薈口瘡緩釋藥膜的臨床前研究。臨床前研究的主要內(nèi)容包括：制備工藝、理化性質(zhì)、純度、檢驗方法、處方篩選、劑型、穩(wěn)定性、質(zhì)量標準、藥理、毒理等研究。
　　實驗?zāi)康模?br>　　1.活性蘆薈口瘡緩釋藥膜是局部治療復(fù)發(fā)性口瘡的藥物之一?；钚蕴J薈口瘡緩釋藥膜是延邊大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院研制而成的。它具有止痛、消炎、促進口腔潰瘍愈合作用的藥物。為了檢測活性蘆薈口瘡緩釋藥膜的藥物對細菌敏感性分析，做

5、活性蘆薈口瘡緩釋藥膜藥物敏感性實驗。
　　2.活性蘆薈口瘡緩釋藥膜是近年來發(fā)展起來新劑型，其中膜劑能夠通過粘附，牢固粘附在口腔粘膜表面，具有保護創(chuàng)面，提高局部藥物濃度，迅速止痛，延長藥物作用時間的作用。雖然有新鮮蘆薈及蘆薈干粉劑安全應(yīng)用于臨床的報道，但蘆薈乙醇提取物能否安全應(yīng)用于臨床，是否對粘膜有刺激性尚未見報道。故進行活性蘆薈口瘡緩釋藥膜的急性毒理實驗以確定藥膜的安全性。
　　3.蘆薈中的蘆薈多糖具有免疫機能修復(fù)及細胞再生

6、等功效?；钚蕴J薈與達克羅寧配伍制成的口腔活性蘆薈口瘡緩釋藥膜安全、無毒，為觀察其療效制作創(chuàng)傷性口腔潰瘍動物膜型實驗，進行創(chuàng)傷性潰瘍動物膜型愈合的研究，為今后的進一步的開發(fā)應(yīng)用研究提供科學(xué)的依據(jù)。
　　4.活性蘆薈口瘡緩釋藥膜是采用理化性質(zhì)穩(wěn)定、親水性大、透氣性強的材料作為成膜材料?，F(xiàn)代研究表明蘆薈具有抗癌、抗炎、抗病毒、抗菌殺蟲、解熱保肝、增強免疫等功效，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)、日用工業(yè)、美容化妝和食品保健等各個領(lǐng)域，因而蘆薈是一種具

7、有較高經(jīng)濟價值的藥用植物。為了測定活性蘆薈口瘡緩釋藥膜中的有效含量并制定藥膜制劑中含量標準，通過高效液相色譜法（HPLC）實驗建立了活性蘆薈口瘡緩釋藥膜有效含量標準。
　　實驗方法：
　　1.活性蘆薈口瘡緩釋藥膜制備：0.5%蘆薈藥膜中活性蘆薈0.5克，1.0%蘆薈藥膜中1.0克；1.5%蘆薈藥膜中1.5克，其余藥品重量相同（達克羅寧0.5克，吐溫-800.5ml，甘油2.0ml,加飽和羥丙基纖維素液至100ml）。空白膜：

8、吐溫-80：0.5ml;甘油：2.0ml;加飽和羥丙基纖維素液至100ml。以上藥物充分混勻，靜置12小時，消除氣泡，于玻璃板上涂膜，待自然風干后選擇厚薄均勻的藥膜切成2×2cm大小，消毒，裝袋密封備用。
　　2.活性蘆薈口瘡緩釋藥膜藥物敏感實驗：活性蘆薈口瘡緩釋藥膜（延邊大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院提供），所有菌株均來源為延邊大學(xué)附屬醫(yī)院住院和門診病人中分離的菌株。儀器為Microscan自動細菌鑒定、藥物敏感分析儀及紙片擴散確證法進行檢測。

9、挑取菌落，在35℃，培養(yǎng)16~18h，按照Microscan自動分析儀及NCCLS標準來判讀結(jié)果。
　　3.活性蘆薈口瘡緩釋藥膜急性毒理實驗：實驗采用雙盲法。18只家兔，隨機分為a、b、 c三組，每組6只，雌雄各半，每組左眼作為對照組，右眼作為實驗組。a組：左眼空白膜(a1組)，右眼0.5%蘆薈藥膜(a2組)；b組：左眼空白膜(b1組)，右眼1.0％蘆薈藥膜(b2組)；c組：左眼空白膜(c1組)，右眼1.5％蘆薈藥膜(c2組)；將

10、蘆薈藥膜切成0.4cmx0.4cm大小，貼附于眼結(jié)膜,每日給藥三次，連續(xù)給藥7天，觀察第6小時，24小時，48小時至第14天眼結(jié)膜變化。觀察內(nèi)容及評分標準：角膜觀察有無混濁；虹膜觀察有無病理變化；結(jié)膜觀察是否充血、水腫、有無分泌物等按眼刺激反應(yīng)評分要求及眼刺激的評分標準，進行評分，最后計算平均分：0~3.9分—無刺激性；4~8.9分—輕度刺激性；9~12.9分—中度刺激性；13~16—重度刺激性。2統(tǒng)計處理：以上數(shù)據(jù)用 SPSS13.0

11、中General Linear Model(廣義線性膜型)中的Repeated Measures…中的統(tǒng)計方法及多元方差分析方法進行統(tǒng)計學(xué)處理。
　　4.活性蘆薈口瘡緩釋藥膜動物潰瘍膜型實驗：活性蘆薈口瘡緩釋藥膜制備方法低劑量活性蘆薈口瘡緩釋藥膜：活性蘆薈粉1.0克，達克羅寧0.5克，吐溫-800.5ml，甘油1.0ml，加飽和羥丙甲基纖維素液至100ml；中劑量活性蘆薈口瘡緩釋藥膜：活性蘆薈粉1.5克，其余同低劑量；高劑量活性蘆

12、薈口瘡緩釋藥膜：活性蘆薈粉2.0克，其余同低劑量；空白藥膜：達克羅寧0.5克，吐溫-800.5ml，甘油1.0ml，加飽和羥丙甲基纖維素液100ml，不含活性蘆薈粉。制成膜劑，選擇厚薄均勻的藥膜切成3.0×3.0cm大小，紫外線消毒，裝袋密封備用。建立大鼠人工口腔潰瘍膜型：乙醚麻醉下，用含90%石炭酸棉球的塑料管（直徑-6mm）置于大鼠左右兩側(cè)距口角1毫米處頰膜灼燒30秒，使局部成灰白色，于次日形成約直徑約6mm的潰瘍。實驗分組及給藥方

13、法分為實驗設(shè)計：于潰瘍形成當日，將大鼠隨機分成5組：A組（空白膜組）；B組（西瓜霜組）；C組（低劑量藥膜組）；D（中劑量藥膜組）；E（高劑量藥膜組）。每組13只，其中5只用于療效觀察，另外8只作病理檢查。給藥方法：將活性蘆薈藥膜（高、中、低劑量）及空白膜切成0.7cm×0.7cm左右，覆蓋潰瘍創(chuàng)面；西瓜霜組將西瓜霜噴于潰瘍表面，五組給藥均為每日兩次。給藥前和每次給藥后次日觀察潰瘍直徑大小及潰瘍愈合情況。組織病理學(xué)檢查于用藥后2、4、6、

14、8天時采取潰瘍區(qū)病理標本，常規(guī)處理、切片、HE染色、光鏡下觀察。統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件中的方差分析和秩和檢驗進行統(tǒng)計分析。
　　5.活性蘆薈口瘡緩釋藥膜中有效成分含量及標準制定方法：高效液相色譜分析條件色譜柱：ZORBAX-SA-C18柱（5μm，200mm×4.6mm）；流動相：甲醇-水（體積比70:30）；流速：1.0 mL／min；柱溫25℃；蘆薈苷檢測波長：360nm，蘆薈大黃素檢測波長：430nm；進樣量

15、：20μl。高效液相色譜分析條件的標準曲線建立、精密度實驗、穩(wěn)定性試驗、重現(xiàn)性實驗、加樣回收率實驗、活性蘆薈口瘡緩釋藥膜中蘆薈苷和蘆薈大黃素的含量測定?；钚蕴J薈口瘡緩釋藥膜制備（延邊大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院提供）。
　　實驗結(jié)果：
　　1.活性蘆薈口瘡緩釋藥膜藥物敏感實驗結(jié)果：活性蘆薈口瘡緩釋藥膜對金黃色葡萄球菌類（68.57%）、表皮葡萄球菌（65.63%）、腐生葡萄球菌（66.67%）、溶血葡萄球菌（70.97%）、卡他布蘭漢氏菌

16、（72.73%）、綠膿桿菌（70.97）、大腸桿菌（75%）等細菌具有一定的敏感性。但洛菲氏不幼桿菌（33.33%）、海魚弧菌（25.00%）、豬葡萄球菌（19.89%）等細菌敏感性較低。
　　2.活性蘆薈口瘡緩釋藥膜急性毒理實驗結(jié)果：在整個實驗過程中所有家兔均未出現(xiàn)角膜及虹膜反應(yīng)，結(jié)膜無水腫反應(yīng)，僅有結(jié)膜充血及少量分泌物產(chǎn)生，所有家兔最后計算平均分最高1.200分，最低0分，均小于3.9分。對組內(nèi)因素進行的檢驗。組內(nèi)隨時間變化，

17、刺激得分存在差異。分組因素對各時間段刺激作用沒有影響。各組間兩兩比較（LSD法）的檢驗結(jié)果，說明這五組間刺激評分無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3.活性蘆薈口瘡緩釋藥膜本次試驗結(jié)果：（1）中觀察創(chuàng)傷性口腔潰瘍膜型的潰瘍面積的變化速度如下，活性蘆薈口瘡藥膜治療4天后B、C、D、E組的潰瘍直徑縮小明顯快于A型組(P﹤0.01)，且在治療6天后開始D組潰瘍直徑縮小效果明顯優(yōu)于B組(P﹤0.01)。本試驗結(jié)果（2）中觀察創(chuàng)傷潰瘍膜型的潰瘍愈合時間如下

18、，B、C、D、E組潰瘍愈合時間均比A組短（P﹤0.01），潰瘍愈合時間D組與B組比較具有顯著差異（P﹤0.01）。本試驗結(jié)果（3）組織病理學(xué)觀察中也得出檢查炎癥的減輕,上皮組織的修復(fù)等均明顯優(yōu)于空白膜組及西瓜霜組。尤其是同空白膜比較可知活性蘆薈發(fā)揮了主要作用。
　　4.高效液相色譜法測定活性蘆薈口瘡緩釋藥膜穩(wěn)定性和有效成分含量標準實驗結(jié)果：高效液相色譜法在一定濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積線性良好，含量測定回收率高，重現(xiàn)性好，具有方法簡便

19、、快捷、準確、靈敏度高等特點。測得活性蘆薈口瘡緩釋藥膜1片（1cm×1cm）中蘆薈苷和蘆薈大黃素的含量標準規(guī)定為蘆薈苷40.67μg、蘆薈大黃素1.8μg。結(jié)論：
　　1.活性蘆薈口瘡緩釋藥膜通過口腔細菌有抑菌作用。
　　2.活性蘆薈口瘡緩釋藥膜無毒性反應(yīng)，是安全、無毒的藥膜。3.活性蘆薈口瘡緩釋藥膜對動物潰瘍膜型治療療效確切。
　　4.活性蘆薈口瘡緩釋藥膜含量標準規(guī)定為蘆薈苷40.67μg、蘆薈大黃素1.8μg。