基于“腎主骨生髓”理論的補(bǔ)腎中藥聯(lián)合BMP-2誘導(dǎo)人臍血MSCs體外成骨分化的研究.pdf

1、目的：建立人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外分離培養(yǎng)體系，觀察體外培養(yǎng)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及補(bǔ)腎中藥與BMP-2聯(lián)合作用對(duì)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、成骨活性的影響，探討其對(duì)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞定向成骨分化的誘導(dǎo)作用。
　　 方法：取30只SD大鼠，補(bǔ)腎中藥連續(xù)灌胃7天，頸總動(dòng)脈取血制備補(bǔ)腎中藥血清。采集人臍血標(biāo)本，密度梯度離心法分離人臍血MSCs，倒置相差顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)人臍血MSCs的生物學(xué)特性，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表

2、型鑒定，取第3代人臍血MSCs分為8組，即空白對(duì)照組、5％中藥血清組、10%中藥血清組、15%中藥血清組,5%中藥血清+50ng/m1BMP-2組、10%中藥血清+50ng/m1BMP-2組、15%中藥血清+50ng/m1BMP-2組、50ng/m1BMP-2組。分別于誘導(dǎo)后1d、3d、5d采用MTT法檢測(cè)不同條件對(duì)人臍血MSCs增殖的影響，誘導(dǎo)后3d、6d、9d、12d通過堿性磷酸酶染色及礦化結(jié)節(jié)VonKossa染色觀察人臍血MSCs

3、定向成骨分化的成骨活性，放射免疫法計(jì)算各組培養(yǎng)液內(nèi)骨鈣素(BGP)含量，鈣離子熒光探針技術(shù)檢測(cè)成骨細(xì)胞內(nèi)鈣離子分泌情況及免疫組織化學(xué)染包分析檢測(cè)各組中成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原的表達(dá)。
　　 結(jié)果：①原代培養(yǎng)的人臍血MSCs呈圓形，72h后僅見少量貼壁細(xì)胞，近似圓形或橢圓形，7d后首次換液可見分散的MSCs小集落，呈放射狀生長(zhǎng)。2周時(shí)細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形,3周后細(xì)胞集落彼此融合。傳代細(xì)胞大部分24h內(nèi)貼壁，一般3d即可達(dá)到80%～90%融合，

4、細(xì)胞排列緊密，以梭形為主。
　　 ②在第3d和第5d時(shí),5%、10%中藥血清+BMP-2組和BMP-2組均能夠促進(jìn)人臍血MSCs的增值(P＜0.05)，尤以5%中藥+BMP-2組、BMP-2為佳(P＜0.01)，且5%中藥+BMP-2組優(yōu)于BMP-2組，第5d兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041＜0.05)。各中藥血清組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 ③誘導(dǎo)后第6d、9d、12d，與對(duì)照組比較，

5、BMP-2組均能提高培養(yǎng)細(xì)胞上清的骨鈣素(BGP)含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.049、0.012、0.021＜0.05)。而5%中藥血清+BMP-2組在誘導(dǎo)第9d時(shí)的BGP含量與對(duì)照組比較差異有顯著性意義(P=0.004＜0.01)，作用最為顯著。
　　 ④誘導(dǎo)后各組ALP活性逐漸增強(qiáng)，與對(duì)照組比較，BMP-2組、補(bǔ)腎中藥與BMP-2聯(lián)合組在誘導(dǎo)后3、6、9、12d均能提高ALP活性(P＜0.05)；5%中藥血清+BM

6、P-2組在誘導(dǎo)第6d時(shí)ALP活性與BMP-2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011＜0.05)。
　　 第7dALP染色陽性表達(dá)較弱，第14dALP染色呈陽性，細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)彌散性紅棕色或咖啡色顆粒，但強(qiáng)弱不等，其中對(duì)照組陽性表達(dá)較弱,5%補(bǔ)腎中藥聯(lián)合BMP-2及BMP-2組較為顯著，而聯(lián)合組陽性表達(dá)最優(yōu)，第21d染色陽性表達(dá)有所減弱。
　　 ⑤誘導(dǎo)后第14dvonKossa染色可見細(xì)胞間散在黑色顆粒，顆粒大小不均一，對(duì)

7、照組細(xì)胞vonKossa染色未見黑色礦化物沉積。其中5%補(bǔ)腎中藥聯(lián)合BMP-2組較其他各組明顯。
　　 ⑥鈣離子熒光探針技術(shù)檢測(cè)顯示BMP-2組及補(bǔ)腎中藥聯(lián)合BMP-2組細(xì)胞內(nèi)鈣離子分泌多于對(duì)照組及單純補(bǔ)腎中藥組。其中5%補(bǔ)腎中藥聯(lián)合BMP-2組熒光強(qiáng)度最為明顯。
　　 ⑦免疫組織化學(xué)染色Ⅰ型膠原陽性表達(dá)為棕黃色顆粒，BMP-2組和5%補(bǔ)腎中藥+BMP-2組均呈陽性表達(dá)，單純補(bǔ)腎中藥組和對(duì)照組表達(dá)則不明顯。