基于“腎主骨生髓”理論的補腎中藥聯(lián)合BMP-2誘導人臍血MSCs體外成骨分化的研究.pdf

1、目的：建立人臍血間充質干細胞(MSCs)體外分離培養(yǎng)體系，觀察體外培養(yǎng)人臍血間充質干細胞的生物學特性及補腎中藥與BMP-2聯(lián)合作用對人臍血間充質干細胞增殖、成骨活性的影響，探討其對人臍血間充質干細胞定向成骨分化的誘導作用。
　　 方法：取30只SD大鼠，補腎中藥連續(xù)灌胃7天，頸總動脈取血制備補腎中藥血清。采集人臍血標本，密度梯度離心法分離人臍血MSCs，倒置相差顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)人臍血MSCs的生物學特性，流式細胞儀進行細胞表

2、型鑒定，取第3代人臍血MSCs分為8組，即空白對照組、5％中藥血清組、10%中藥血清組、15%中藥血清組,5%中藥血清+50ng/m1BMP-2組、10%中藥血清+50ng/m1BMP-2組、15%中藥血清+50ng/m1BMP-2組、50ng/m1BMP-2組。分別于誘導后1d、3d、5d采用MTT法檢測不同條件對人臍血MSCs增殖的影響，誘導后3d、6d、9d、12d通過堿性磷酸酶染色及礦化結節(jié)VonKossa染色觀察人臍血MSCs

3、定向成骨分化的成骨活性，放射免疫法計算各組培養(yǎng)液內骨鈣素(BGP)含量，鈣離子熒光探針技術檢測成骨細胞內鈣離子分泌情況及免疫組織化學染包分析檢測各組中成骨細胞Ⅰ型膠原的表達。
　　 結果：①原代培養(yǎng)的人臍血MSCs呈圓形，72h后僅見少量貼壁細胞，近似圓形或橢圓形，7d后首次換液可見分散的MSCs小集落，呈放射狀生長。2周時細胞形態(tài)呈長梭形,3周后細胞集落彼此融合。傳代細胞大部分24h內貼壁，一般3d即可達到80%～90%融合，

4、細胞排列緊密，以梭形為主。
　　 ②在第3d和第5d時,5%、10%中藥血清+BMP-2組和BMP-2組均能夠促進人臍血MSCs的增值(P＜0.05)，尤以5%中藥+BMP-2組、BMP-2為佳(P＜0.01)，且5%中藥+BMP-2組優(yōu)于BMP-2組，第5d兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.041＜0.05)。各中藥血清組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 ③誘導后第6d、9d、12d，與對照組比較，

5、BMP-2組均能提高培養(yǎng)細胞上清的骨鈣素(BGP)含量，差異有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.049、0.012、0.021＜0.05)。而5%中藥血清+BMP-2組在誘導第9d時的BGP含量與對照組比較差異有顯著性意義(P=0.004＜0.01)，作用最為顯著。
　　 ④誘導后各組ALP活性逐漸增強，與對照組比較，BMP-2組、補腎中藥與BMP-2聯(lián)合組在誘導后3、6、9、12d均能提高ALP活性(P＜0.05)；5%中藥血清+BM

6、P-2組在誘導第6d時ALP活性與BMP-2組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.011＜0.05)。
　　 第7dALP染色陽性表達較弱，第14dALP染色呈陽性，細胞漿內出現(xiàn)彌散性紅棕色或咖啡色顆粒，但強弱不等，其中對照組陽性表達較弱,5%補腎中藥聯(lián)合BMP-2及BMP-2組較為顯著，而聯(lián)合組陽性表達最優(yōu)，第21d染色陽性表達有所減弱。
　　 ⑤誘導后第14dvonKossa染色可見細胞間散在黑色顆粒，顆粒大小不均一，對

7、照組細胞vonKossa染色未見黑色礦化物沉積。其中5%補腎中藥聯(lián)合BMP-2組較其他各組明顯。
　　 ⑥鈣離子熒光探針技術檢測顯示BMP-2組及補腎中藥聯(lián)合BMP-2組細胞內鈣離子分泌多于對照組及單純補腎中藥組。其中5%補腎中藥聯(lián)合BMP-2組熒光強度最為明顯。
　　 ⑦免疫組織化學染色Ⅰ型膠原陽性表達為棕黃色顆粒，BMP-2組和5%補腎中藥+BMP-2組均呈陽性表達，單純補腎中藥組和對照組表達則不明顯。