華北大黑鰓金龜OBPs異源二聚體對(duì)氣味分子的識(shí)別機(jī)制.pdf

1、華北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita Faldermann)隸屬鞘翅目，鰓金龜科，其幼蟲蠐螬，是花生、大豆、小麥、玉米、馬鈴薯等作物的重要地下害蟲，危害嚴(yán)重，防治困難。采用“地下害蟲，地上防治”、“防治成蟲，控制幼蟲”的策略，尋找一種高效、無污染的華北大黑鰓金龜成蟲防治新途徑已成為當(dāng)務(wù)之急，其中利用寄主植物的揮發(fā)物誘殺成蟲是目前華北大黑鰓金龜防治的一種潛在綠色防控技術(shù)。本文以闡明其成蟲觸角中兩種氣味結(jié)合蛋白(HoblOB

2、P1和HoblOBP2)的互作能增強(qiáng)對(duì)氣味化合物的結(jié)合能力為目標(biāo);通過熒光原位雜交技術(shù)證明了HoblOBP1和HoblOBP2在成蟲觸角中的共表達(dá);利用蛋白分子對(duì)接技術(shù)對(duì)兩蛋白的結(jié)合模式及其兩蛋白復(fù)合物與氣味分子的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析;采用定點(diǎn)突變技術(shù)，獲得特定的突變基因，進(jìn)而表達(dá)純化以獲得不同的突變蛋白;通過熒光結(jié)合實(shí)驗(yàn)明確不同結(jié)合位點(diǎn)在HoblOBP1/OBP2復(fù)合物識(shí)別活性氣味分子中的影響，從而解析OBPs異源二聚體的形成機(jī)

3、制及其對(duì)氣味分子的識(shí)別機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)表明HoblOBP1和HoblOBP2在華北大黑鰓金龜?shù)挠|角感器中共表達(dá)。
　　2.HoblOBP1和HoblOBP2對(duì)接后，構(gòu)建了HoblOBP1/OBP2復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)模型。研究發(fā)現(xiàn)HoblOBP1、HoblOBP2和HoblOBP1/OBP2的結(jié)合口袋分別由68、77和79個(gè)氨基酸殘基組成。尤為重要的是，HoblOBP1/OBP2復(fù)合物的結(jié)合口袋

4、明顯大于任一單一蛋白的結(jié)合口袋，其主要由HoblOBP2提供，HoblOBP1僅提供了一部分。
　　3.在HoblOBP1和HoblOBP2構(gòu)建的蛋白復(fù)合物的結(jié)合口袋分析中，發(fā)現(xiàn)HoblOBP1的三個(gè)氨基酸殘基Asp61、Gly85和Ile87分別與HoblOBP2的Tyr86、Ile75和Asn74相互作用形成了3對(duì)氫鍵。本實(shí)驗(yàn)通過單點(diǎn)突變(HoblOBP1中的Gly85，HoblOBP2中的Asn74和Tyr86)和雙點(diǎn)突變（

5、HoblOBP2中的Asn74和Tyr86）的方式來實(shí)現(xiàn)兩個(gè)蛋白間的一對(duì)、兩對(duì)或三對(duì)氫鍵的斷裂。熒光結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3對(duì)氫鍵均斷裂后，其與探針1-NPN的結(jié)合曲線和Scatchard方程分別呈現(xiàn)上升趨勢(shì)和線性相關(guān)，蛋白混合物與反-2-己烯醇、1-庚醛、R-（-）-芳樟醇和α-松油醇完全不能結(jié)合。當(dāng)斷裂1對(duì)或2對(duì)氫鍵時(shí)，所有的蛋白混合物與1-NPN的結(jié)合曲線和Scatchard方程分別表現(xiàn)下降趨勢(shì)和“J”形狀的向下凹的曲線，帶有HoblO

6、BP1上G85A突變位點(diǎn)的蛋白混合物與化合物仍有較弱的結(jié)合能力。由此表明三對(duì)氫鍵均對(duì)蛋白復(fù)合物與化合物結(jié)合產(chǎn)生影響，但與HoblOBP2-Tyr86/HoblOBP1-Asp61和HoblOBP2-Asn74/HoblOBP1-Ile87這兩對(duì)氫鍵相比，HoblOBP1-Gly85/HoblOBP2-Ile75的影響較小。
　　4.在蛋白復(fù)合物與四種配體對(duì)接分析中，發(fā)現(xiàn)HoblOBP2中的Asn54、Thr71、Asn74、Leu

7、126和Asn127等氨基酸殘基均參與了蛋白與配體間氫鍵的形成。此外，配體分子周圍存在的疏水殘基參與了配體和蛋白的結(jié)合作用，這些疏水殘基主要有HoblOBP1中的Val86，HoblOBP2中的Leu59和Met117。對(duì)HoblOBP2中的5個(gè)氫鍵形成的位點(diǎn)(Asn54，Thr71，Asn74，Leu126和Asn127)和HoblOBP1中的1個(gè)疏水位點(diǎn)(Val86)進(jìn)行單點(diǎn)突變;對(duì)蛋白復(fù)合物與反-2-己烯醇結(jié)合的雙氫鍵位點(diǎn)（Hob

8、lOBP2中的Leu126和Asn127），以及與α-松油醇結(jié)合的雙氫鍵位點(diǎn)（HoblOBP2中的Thr71和Asn74）進(jìn)行雙點(diǎn)突變。熒光結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5個(gè)氫鍵形成位點(diǎn)分別突變成丙氨酸后，蛋白混合物與化合物結(jié)合能力顯著減弱;疏水位點(diǎn)突變后，二者之間仍存在一定的親和性;由此說明蛋白與配體間的疏水鍵對(duì)兩者之間的結(jié)合作用的影響弱于氫鍵。雙點(diǎn)突變后，蛋白混合物對(duì)化合物完全不能結(jié)合;另外，所有突變蛋白混合物與與1-NPN的結(jié)合曲線和Scatc

9、hard方程分別表現(xiàn)下降趨勢(shì)和“J”形狀的向下凹的曲線。
　　本文解析了華北大黑鰓金龜HoblOBP1和HoblOBP2異源二聚體對(duì)氣味分子的識(shí)別機(jī)制，其中兩個(gè)蛋白之間形成的3對(duì)氫鍵是HoblOBP1與HoblOBP2能夠形成異源二聚體的關(guān)鍵作用力，同時(shí)顯著影響蛋白復(fù)合物對(duì)化合物結(jié)合能力。蛋白復(fù)合物與4種化合物之間形成的氫鍵作用是其與化合物能夠結(jié)合的關(guān)鍵因素，形成氫鍵作用的5個(gè)氨基酸位點(diǎn)為蛋白復(fù)合物識(shí)別活性氣味分子的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)。