BMP2-7異源二聚體與全反式維甲酸在體外細(xì)胞成骨中的作用.pdf

1、骨缺損在臨床上十分普遍，而由先天骨發(fā)育不良或發(fā)育畸形以及腫瘤、炎癥、外傷等原因造成的大面積以及極限骨缺損仍是正頜外科、口腔頜面外科以及口腔種植科醫(yī)生所面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是一組具有高度保守結(jié)構(gòu)的二聚體蛋白，屬于轉(zhuǎn)移生長因子(TGF-)超家族成員，在促進(jìn)骨再生研究的領(lǐng)域中是主要的細(xì)胞因子之一。尤其是BMP2同源二聚體和BMP7同源二聚體，先后得到FDA認(rèn)證，可用于脊椎融合術(shù)、修復(fù)骨缺損、加速骨聯(lián)合等方面的輔助治療。

2、BMP2/7異源二聚體較BMP同源二聚體有更高效的誘導(dǎo)成骨作用，其誘導(dǎo)的細(xì)胞ALP活性以及體內(nèi)成骨量是相應(yīng)BMP同源二聚體的數(shù)倍至數(shù)十倍。同時(shí)，BMP同源二聚體在破骨發(fā)生中也發(fā)揮了顯著作用，刺激和調(diào)控破骨細(xì)胞分化，刺激破骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)成熟破骨細(xì)胞的骨吸收功能等。相比與BMP2和BMP7，BMP2/7能在顯著較低的濃度起效誘導(dǎo)細(xì)胞成骨發(fā)生，并在較低濃度范圍內(nèi)達(dá)到與BMP2和BMP7在較高濃度范圍內(nèi)所達(dá)到的作用效果峰值;并且BMP2/7

3、在誘導(dǎo)細(xì)胞破骨發(fā)生過程中并不存在這一特點(diǎn)，即在低濃度范圍內(nèi)促進(jìn)破骨發(fā)生的程度仍然較低，因而可獲得更大的成骨凈效應(yīng)。近期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建立小型豬顱頂骨的極限種植體周圍骨缺損模型，通過micro-CT的掃描檢測和新生骨小梁的數(shù)量、厚度、距離以及新骨結(jié)構(gòu)模型等參數(shù)分析，BMP2/7誘導(dǎo)的新生骨組織量顯著多于BMP2和BMP7組，并且BMP2/7誘導(dǎo)的新生骨組織結(jié)構(gòu)最接近于缺損周邊正常骨組織。
　　此外，有文獻(xiàn)報(bào)道全反式維甲酸(all-tra

4、ns retinoic acid，ATRA)能夠上調(diào)多種細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞等的成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)基質(zhì)礦化。同時(shí)，也有研究報(bào)道指出ATRA與BMP2聯(lián)合應(yīng)用能夠協(xié)同誘導(dǎo)脂肪源細(xì)胞的成骨分化，促進(jìn)顱骨成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的成骨分化，以及通過細(xì)胞介導(dǎo)的組織工程學(xué)技術(shù)促進(jìn)體內(nèi)的成骨細(xì)胞募集和骨組織改建更新。但亦有報(bào)道指出ATRA和BMP協(xié)同抑制細(xì)胞成骨分化并促進(jìn)細(xì)胞成脂分化。故本實(shí)驗(yàn)著重研究ATRA與低劑量

5、BMP2/7對不同種類細(xì)胞成骨分化的影響，及二者聯(lián)合應(yīng)用能否對細(xì)胞成骨分化產(chǎn)生協(xié)同促進(jìn)作用，進(jìn)一步有效促進(jìn)成骨分化和新骨形成。
　　第一部分:BMP2/7異源二聚體與全反式維甲酸對小鼠原成骨細(xì)胞MC3T3-E1的作用
　　目的:
　　BMP2/7異源二聚體較BMP同源二聚體有更高效的誘導(dǎo)成骨作用，其誘導(dǎo)的細(xì)胞ALP活性以及體內(nèi)成骨量是相應(yīng)BMP同源二聚體的數(shù)倍至數(shù)十倍。同時(shí)，BMP同源二聚體在破骨發(fā)生中也發(fā)揮了顯著作用

6、，刺激和調(diào)控破骨細(xì)胞分化，刺激破骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)成熟破骨細(xì)胞的骨吸收功能等。相比與BMP2和BMP7，BMP2/7能在顯著較低的濃度起效誘導(dǎo)細(xì)胞成骨發(fā)生，并在較低濃度范圍內(nèi)達(dá)到與BMP2和BMP7在較高濃度范圍內(nèi)所達(dá)到的作用效果峰值;并且BMP2/7在誘導(dǎo)細(xì)胞破骨發(fā)生過程中并不存在這一特點(diǎn)，即在低濃度范圍內(nèi)促進(jìn)破骨發(fā)生的程度仍然較低，因而可獲得更大的成骨凈效應(yīng)。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)能

7、夠上調(diào)多種細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞等的成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)基質(zhì)礦化。同時(shí)，也有研究報(bào)道指出ATRA與BMP2聯(lián)合應(yīng)用能夠協(xié)同誘導(dǎo)脂肪源細(xì)胞的成骨分化，促進(jìn)顱骨成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的成骨分化，以及通過細(xì)胞介導(dǎo)的組織工程學(xué)技術(shù)促進(jìn)體內(nèi)的成骨細(xì)胞募集和骨組織改建更新。但亦有報(bào)道指出ATRA和BMP協(xié)同抑制細(xì)胞成骨分化并促進(jìn)細(xì)胞成脂分化。本研究旨在探討rhBMP2/7異源二聚體和ATRA分別對小鼠原成骨細(xì)胞MC3T

8、3-E1的作用，二者之間是否存在協(xié)同誘導(dǎo)小鼠原成骨細(xì)胞MC3T3-E1成骨的作用及其體外誘導(dǎo)成骨發(fā)生的具體生物學(xué)功能特點(diǎn)。
　　材料和方法:
　　以不同濃度的rhBMP2/7異源二聚體(5ng/ml，50ng/ml)及ATRA（1uM）作用于小鼠原成骨細(xì)胞MC3T3-E1，并設(shè)立對照組，檢測rhBMP2/7和ATRA及二者聯(lián)合應(yīng)用在誘導(dǎo)成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1成骨發(fā)生過程中的作用，檢測成骨發(fā)生各階段的相關(guān)指標(biāo)。用熒光定量

9、法檢測細(xì)胞增殖后的細(xì)胞個(gè)數(shù);用比色法檢測細(xì)胞成骨分化早期指標(biāo)堿性磷酸酶(ALP)活性;用ELISA方法檢測成骨分化晚期指標(biāo)細(xì)胞骨鈣素(OCN)的分泌量;用RT-PCR法檢測細(xì)胞成骨相關(guān)基因(ALP、OCN、Col1、Runx2)的表達(dá)水平;用茜素紅染色觀察并計(jì)量細(xì)胞礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞外基質(zhì)礦化結(jié)節(jié)面積及吸光度。
　　結(jié)果:
　　細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)1天時(shí)，僅單純50ng/ml BMP2/7組細(xì)胞數(shù)明顯增加，而其他5組并未發(fā)現(xiàn)明

10、顯的抑制或促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。第4天時(shí)，單純ATRA對細(xì)胞增殖具有抑制作用，但ATRA對細(xì)胞增殖的這種抑制作用，可以通過添加5ng/ml或50ng/ml BMP2/7予以補(bǔ)償。而5ng/ml或50ng/ml BMP2/7單獨(dú)作用下，細(xì)胞增殖均較其他組顯著。但ATRA未明顯影響細(xì)胞ALP活性，無論是否添加ATRA，BMP2/7在任一時(shí)間點(diǎn)均可明顯促進(jìn)細(xì)胞ALP活性表達(dá)，并且具有濃度依賴性。ATRA對細(xì)胞OCN表達(dá)的影響較其對細(xì)胞增殖的影響

11、相似，在第4天和第7天ATRA均能明顯抑制細(xì)胞OCN表達(dá)，第4天時(shí)，5ng/ml BMP2/7即可完全拮抗ATRA對OCN表達(dá)所產(chǎn)生的抑制作用，使而二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)OCN表達(dá)水平與空白對照組OCN表達(dá)水平相近。然而在第7天時(shí)，其對ATRA所產(chǎn)生的拮抗作用有所減弱。總之，ATRA在任一時(shí)間點(diǎn)均可抑制BMP2/7引起的OCN的表達(dá)。茜素紅染色結(jié)果顯示，1uM ATRA可以明顯抑制細(xì)胞外基質(zhì)礦化。5ng/ml BMP2/7+ATRA組細(xì)胞外基質(zhì)

12、礦化面積明顯低于空白對照組，而50ng/ml BMP2/7則可完全拮抗ATRA對細(xì)胞外基質(zhì)礦化所產(chǎn)生的的抑制作用，二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)礦化面積約為空白對照組的2.5倍。單純50ng/ml BMP2/7作用下細(xì)胞外基質(zhì)礦化最為明顯。基因研究結(jié)果顯示在第一天，無論是否添加BMP2/7，ATRA均顯著抑制Runx2基因的表達(dá)。然而，單純ATRA則可在第4天和第7天時(shí)明顯促進(jìn)Runx2的基因表達(dá)。BMP2/7對Runx2基因表達(dá)的促進(jìn)作用則

13、表現(xiàn)為濃度依賴型。任一時(shí)間點(diǎn)時(shí)，ATRA均可明顯抑制Ⅰ型膠原基因的表達(dá)，而5ng/ml BMP2/7在任一時(shí)間均可完全拮抗由ATRA產(chǎn)生的這種對Ⅰ型膠原基因表達(dá)的抑制作用。50ng/ml BMP2/7在第一天和第7天時(shí)亦可產(chǎn)生與5ng/ml BMP2/7相同的作用，并且在第四天時(shí)50ng/ml BMP2/7可明顯促進(jìn)Ⅰ型膠原基因的表達(dá)。與ALP活性表達(dá)不同的是，ATRA在任一時(shí)間點(diǎn)均抑制ALP基因的表達(dá)。5ng/ml和50ng/ml B

14、MP2/7均能拮抗ATRA對細(xì)胞ALP基因所產(chǎn)生的抑制作用，并促進(jìn)細(xì)胞ALP基因的表達(dá)。單純BMP2/7對細(xì)胞OCN基因表達(dá)水平則具有明顯促進(jìn)作用，且具有一定的濃度依賴性，但在第4天和第7天ATRA均能明顯抑制BMP2/7所誘導(dǎo)的OCN基因表達(dá)。任一時(shí)間點(diǎn)，單純ATRA均可明顯抑制OCN基因表達(dá)，5ng/ml BMP2/7即可完全拮抗由ATRA所產(chǎn)生的抑制作用，而50ng/ml BMP2/7不僅可以完全拮抗ATRA所產(chǎn)生的拮抗作用，而且

15、可明顯促進(jìn)細(xì)胞OCN基因的表達(dá)。無論是否添加ATRA，BMP2/7對細(xì)胞OCN基因表達(dá)的促進(jìn)作用均呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性。而第4天和第7天時(shí)，ATRA均能明顯抑制由5或50ng/ml BMP2/7所引起的OCN基因的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　ATRA抑制小鼠原成骨細(xì)胞MC3T3-E1的成骨分化，BMP2/7促進(jìn)小鼠原成骨細(xì)胞MC3T3-E1的成骨分化，并呈現(xiàn)濃度依賴性;ATRA與BMP2/7間并不存在協(xié)同誘導(dǎo)小鼠原成骨細(xì)胞MC3

16、T3-E1成骨分化的作用，而BMP2/7可拮抗ATRA對細(xì)胞成骨分化所產(chǎn)生的抑制作用并明顯促進(jìn)細(xì)胞成骨分化。
　　第二部分:BMP2/7異源二聚體與全反式維甲酸對SD大鼠BMSC成骨分化的作用
　　目的:
　　BMP2/7異源二聚體較BMP同源二聚體有更高效的誘導(dǎo)成骨作用，其誘導(dǎo)的細(xì)胞ALP活性以及體內(nèi)成骨量是相應(yīng)BMP同源二聚體的數(shù)倍至數(shù)十倍。同時(shí)，BMP同源二聚體在破骨發(fā)生中也發(fā)揮了顯著作用，刺激和調(diào)控破骨細(xì)胞分化

17、，刺激破骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)成熟破骨細(xì)胞的骨吸收功能等。相比與BMP2和BMP7，BMP2/7能在顯著較低的濃度起效誘導(dǎo)細(xì)胞成骨發(fā)生，并在較低濃度范圍內(nèi)達(dá)到與BMP2和BMP7在較高濃度范圍內(nèi)所達(dá)到的作用效果峰值;并且BMP2/7在誘導(dǎo)細(xì)胞破骨發(fā)生過程中并不存在這一特點(diǎn)，即在低濃度范圍內(nèi)促進(jìn)破骨發(fā)生的程度仍然較低，因而可獲得更大的成骨凈效應(yīng)。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)能夠上調(diào)多種細(xì)胞，包括成骨

18、細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞等的成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)基質(zhì)礦化。同時(shí)，也有研究報(bào)道指出ATRA與BMP2聯(lián)合應(yīng)用能夠協(xié)同誘導(dǎo)脂肪源細(xì)胞的成骨分化，促進(jìn)顱骨成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的成骨分化，以及通過細(xì)胞介導(dǎo)的組織工程學(xué)技術(shù)促進(jìn)體內(nèi)的成骨細(xì)胞募集和骨組織改建更新。本研究旨在探討rhBMP2/7異源二聚體和ATRA誘導(dǎo)大鼠原代BMSC成骨分化的作用，二者之間是否存在協(xié)同誘導(dǎo)小大鼠原代BMSC成骨分化作用及其體外誘導(dǎo)成骨發(fā)生的具體生物學(xué)

19、功能特點(diǎn)。
　　材料和方法:
　　獲取SD大鼠脛骨及股骨原代BMSCs，流失細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞純度后以不同濃度的rhBMP2/7異源二聚體(5ng/ml，50ng/ml)及ATRA（1uM）作用于大鼠原代BMSC成骨分化，并設(shè)立對照組，檢測rhBMP2/7和ATRA及二者聯(lián)合應(yīng)用在誘導(dǎo)大鼠原代BMSC成骨發(fā)生過程中的作用，檢測成骨發(fā)生各階段的相關(guān)指標(biāo)。用熒光定量法檢測細(xì)胞增殖后的各組DNA含量;用比色法檢測細(xì)胞成骨分化早期指標(biāo)堿

20、性磷酸酶(ALP)活性;用ELISA方法檢測成骨分化晚期指標(biāo)細(xì)胞骨鈣素(OCN)的分泌量;用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測細(xì)胞成骨相關(guān)基因（ALP、OCN、Runx2）的表達(dá)水平;用茜素紅染色觀察并計(jì)量細(xì)胞礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞外基質(zhì)礦化結(jié)節(jié)面積。
　　結(jié)果:
　　單純ATRA作用下，細(xì)胞增殖明顯被抑制，第七天DNA含量僅較第四天略有提升，而BMP2/7可以對抗ATRA對細(xì)胞增殖產(chǎn)生的抑制作用，在第四天，ATRA聯(lián)合應(yīng)用5ng

21、/ml及50ng/ml的BMP2/7較單獨(dú)應(yīng)用ATRA，均可以明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，而在第七天時(shí)，與單獨(dú)應(yīng)用ATRA相比，ATRA與50ng/ml BMP2/7聯(lián)合應(yīng)用亦使DNA含量明顯增高。不同于ATRA和BMP2/7對細(xì)胞增殖的影響，ATRA.和BMP2/7均能明顯促進(jìn)BMSC在第四天及第七天ALP活性表達(dá)。任一時(shí)間點(diǎn)，ATRA與BMP2/7(5ng/ml，50ng/ml)聯(lián)合作用下，均可明顯促進(jìn)細(xì)胞ALP的活性表達(dá)。第七天，ATRA與

22、50ng/ml協(xié)同促進(jìn)BMSC ALP活性表達(dá)水平則達(dá)到空白組ALP活性表達(dá)水平的7.01倍。BMP2/7對細(xì)胞OCN水平具有促進(jìn)作用，并隨BMP2/7濃度的增加而增加。然而，任一時(shí)間點(diǎn)，單純ATRA作用時(shí)明顯抑制了OCN的表達(dá)。在ATRA作用下，BMP2/7對OCN表達(dá)水平的作用則表現(xiàn)為濃度和時(shí)間依賴性。細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)14天后，僅BMP2/750ng/ml組出現(xiàn)基質(zhì)礦化，細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)21天后，空白對照組及單純ATRA作用組僅可檢

23、測到極少量的鈣鹽沉積，可見單純ATRA對BMSC細(xì)胞礦化僅有極小的影響。BMP2/7含或不合ATRA均能明顯促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)礦化，并且細(xì)胞外基質(zhì)礦化面積隨BMP2/7濃度的增加而增加。ATRA明顯下調(diào)5ng/ml BMP2/7所誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)礦化，但這種抑制作用在50ng/ml BMP2/7時(shí)則并不存在。單純5ng/ml BMP2/7或者ATRA刺激培養(yǎng)7天后才能明顯促進(jìn)Runx2基因的表達(dá)。50ng/ml BMP2/7在細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)

24、4天和7天時(shí)均能明顯促進(jìn)Runx2基因的表達(dá)，與單純ATRA組及5ng/ml BMP2/7+ATRA組相比，50ng/ml BMP2/7+ATRA組則明顯促進(jìn)Runx2基因的表達(dá)。與ALP活性表達(dá)不同的是，在第4天時(shí)，ATRA并沒有明顯影響ALP基因的表達(dá)，在第7天時(shí)，ATRA對ALP基因的表達(dá)表現(xiàn)出明顯的抑制作用。單純5ng/ml BMP2/7和50ng/ml BMP2/7則在細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)第7天時(shí)表現(xiàn)為促進(jìn)作用。細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)第

25、4天時(shí)，與空白對照組相比，ATRA和任一濃度的BMP2/7共同作用均能明顯促進(jìn)ALP基因的表達(dá)。與第4天相比，ATRA和50ng/ml BMP2/7在第7天時(shí)明顯促進(jìn)細(xì)胞ALP基因表達(dá)。細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)7天時(shí)，空白對照組及單純BMP2/7作用組的細(xì)胞OCN基因表達(dá)水平較4天時(shí)明顯上升，在第7天時(shí)，任何BMP2/7濃度(0ng/ml，5ng/ml，50ng/ml)下ATRA均能明顯抑制細(xì)胞OCN基因表達(dá)水平，而這種抑制現(xiàn)在在細(xì)胞因子刺激培

26、養(yǎng)4天時(shí)并未出現(xiàn)。
　　結(jié)論:
　　BMP2/7促進(jìn)SD大鼠BMSCs成骨分化，并呈現(xiàn)濃度依賴性。BMP2/7和ATRA協(xié)同誘導(dǎo)SD大鼠BMSCs成骨早期分化，促進(jìn)ALP活性表達(dá)，但ATRA抑制BMSC中晚期成骨分化，抑制細(xì)胞外基質(zhì)礦化，而BMP2/7促進(jìn)BMSC成骨分化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)礦化，并呈濃度依賴性，ATRA可抑制低濃度BMP2/7誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化的能力，而相對高濃度BMP2/7誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化的能力不受ATRA影響