大氣顆粒污染物對(duì)大鼠膀胱功能的影響及其作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　擬通過咽后壁滴注大氣顆粒污染物制作大鼠柴油機(jī)尾氣顆粒物(diesel exhaust particles,DEPs)暴露模型,研究DEPs對(duì)膀胱組織毒性作用的劑量-效應(yīng)、時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系及機(jī)制;檢測(cè)DEPs暴露環(huán)境下膀胱組織中縫隙連接蛋白(Connexin,Cx)家族基因的表達(dá),從轉(zhuǎn)錄及翻譯水平闡述Cx43與DEPs暴露的關(guān)系及其生物學(xué)意義;觀測(cè)縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊(Gap junction intercellula

2、r communication,GJIC)與DEPs暴露的關(guān)系,為臨床上采用阻斷細(xì)胞間興奮傳遞來治療DEPs暴露引起的膀胱功能障礙提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.采用咽后壁滴注法建立SD大鼠DEPs暴露模型,80只大鼠隨機(jī)分配于1月和3月不同濃度染毒組(正常組、低劑量染毒組、中劑量染毒組、高劑量染毒組和超高劑量染毒組,即A-E組),每組各8只。觀察膀胱上皮形態(tài)的變化,測(cè)定膀胱組織抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化物水平的改變。

3、r>　　2.采用RT-PCR方法檢測(cè)膀胱組織中Cx家族基因的表達(dá),Q-PCR和Western blotting方法檢測(cè)膀胱平滑肌Cx43的表達(dá)。
　　3.體外培養(yǎng)3月超高劑量染毒組原代膀胱平滑肌細(xì)胞,應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)結(jié)合熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)(FRAP),動(dòng)態(tài)研究膀胱平滑肌細(xì)胞間縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊(GJIC)的功能變化及觀測(cè)縫隙連接阻滯劑18β-GA對(duì)GJIC的影響。
　　結(jié)果:
　　1.采用咽后

4、壁滴注染毒法建立的大鼠DEPs暴露模型方法簡(jiǎn)單,易操作,可重復(fù)性好。
　　2.3月超高劑量DEPs暴露后,TEM觀察發(fā)現(xiàn)膀胱上皮細(xì)胞間有硝酸鑭顆粒物沉積;過碘酸-希夫染色(PAS)染色同樣觀察到膀胱上皮層表面PAS+層的連續(xù)、均一性中斷,GAGs(Sulfated Glycosaminoglycan,GAGs)層完整性缺失,部分膀胱上皮細(xì)胞脫落。
　　3.在3月染毒組的高劑量和超高劑量DEPs作用下,膀胱組織內(nèi)SOD,CAT

5、,GPx和GSH水平出現(xiàn)明顯降低,而TBARS則顯著性增高。CAT活性的變化出現(xiàn)染毒劑量依賴性改變。
　　4.Cx26、Cx32、Cx37、Cx40、Cx43和Cx45mRNA在DEPs暴露組及正常組膀胱平滑肌中均有表達(dá),但缺乏Cx36mRNA。3月暴露組中的超高劑量染毒組中Cx40mRNA和Cx43mRNA表達(dá)均比正常對(duì)照組明顯增加,分別增加3.2和2.9倍(p<0.05),而其它Cx基因表達(dá)無顯著性差異;Cx43蛋白在3月21

6、.02μg/μl濃度暴露組及正常組膀胱平滑肌中均有表達(dá),且前者中的表達(dá)明顯高于后者,約增高2.4倍(p<0.05)。
　　5.膠原酶消化法進(jìn)行的大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng),周期短,獲得的平滑肌細(xì)胞純度高。熒光標(biāo)記染色平滑肌細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)。LSCM結(jié)合FRAP對(duì)平滑肌細(xì)胞間興奮傳遞的功能變化研究發(fā)現(xiàn),在3月21.02μg/μl濃度暴露組中,經(jīng)瞬間漂白后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯變?nèi)?隨著時(shí)間的推移,熒光強(qiáng)度明顯恢復(fù),而正常對(duì)照組,在相同

7、的時(shí)間內(nèi),漂白細(xì)胞熒光恢復(fù)不明顯。
　　6.采用縫隙連接阻滯劑18β-GA對(duì)3月21.02μg/μl濃度暴露組平滑肌細(xì)胞GJIC功能的影響研究發(fā)現(xiàn):18β-GA能明顯降低平滑肌細(xì)胞間的熒光恢復(fù)率,呈濃度依賴相關(guān)性,與作用時(shí)間無明顯關(guān)系。
　　結(jié)論:
　　1.DEPs是一種全身性毒物,對(duì)膀胱組織也有一定的毒效應(yīng)。ROS等自由基引起的氧化損傷可能是DEPs對(duì)膀胱產(chǎn)生毒作用的機(jī)制之一
　　2.高濃度DEPs暴露下,膀胱

8、組織可能通過調(diào)節(jié)Cx基因和蛋白表達(dá)以適應(yīng)環(huán)境變化,機(jī)制可能與DEPs導(dǎo)致膀胱上皮細(xì)胞間隙增寬、膀胱組織內(nèi)環(huán)境氧化還原系統(tǒng)失衡密切相關(guān),但尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　3.縫隙連接是平滑肌細(xì)胞間興奮傳遞的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ);本研究采用FRAP技術(shù)從功能上證明3月21.02μg/μl濃度暴露組平滑肌GJIC功能增強(qiáng);3月超高劑量DEPs暴露組平滑肌細(xì)胞GJIC功能增強(qiáng)可能是DEPs對(duì)膀胱毒性作用的病理機(jī)制之一
　　4.18β-GA作為細(xì)胞