大氣顆粒污染物與臭氧對(duì)高果糖飲食大鼠心表面和腎周脂肪致炎和氧化應(yīng)激作用的研究.pdf

1、[背景]大氣污染介導(dǎo)的心血管疾病(cardiovasculardiseases，CVD)是大氣污染相關(guān)人群死亡的首位病因，世界各地普遍存在大氣污染，其導(dǎo)致的心血管健康問(wèn)題已經(jīng)造成全球巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。系統(tǒng)性炎癥和氧化應(yīng)激在大氣污染物觸發(fā)或加重CVD的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。而大氣污染導(dǎo)致脂肪組織炎癥是環(huán)境與代謝心臟病學(xué)領(lǐng)域新近研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，但對(duì)心表面和腎周脂肪的研究較少，尤其是吸入濃聚大氣微粒子（concentrated

2、ambientparticulates，CAPs）和（或）臭氧(ozone，O3)暴露對(duì)心表面和腎周脂肪的致炎和氧化應(yīng)激作用，目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)相關(guān)研究。
　　 [目的]研究：心表面和腎周脂肪的特征；短期內(nèi)吸入性CAPs和（或）O3暴露，對(duì)心表面和腎周脂肪組織中的白色和棕色脂肪特異性基因表達(dá)的調(diào)控作用，及其對(duì)心表面和腎周脂肪組織的致炎和氧化應(yīng)激作用。
　　 [方法]8周齡大小的美國(guó)斯普拉格—道利(SD)雄性大鼠，隨機(jī)分為8

3、組：4組正常飲食(ND),4組高果糖飲食(HF)，8周后開(kāi)始吸入性CAPs和（或）O3暴露，組別如下：ND-AIR，ND-CAPs，ND-O3，ND-CAPs/O3，HF-AIR，HF-CAPs，HF-O3和HF-CAPs/O3(n=8)。飲食和吸入性大氣污染暴露方案：8h/d,4～5d/w，共2周。所有大鼠均于暴露完成后24h內(nèi)解剖，采集心表面、腎周、肩胛間和大網(wǎng)膜脂等多部位脂肪標(biāo)本。上述大鼠的暴露和脂肪標(biāo)本的采集在美國(guó)密歇根州立大學(xué)

4、(MSU)毒理學(xué)與病理生物學(xué)研究中心完成。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)在美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)戴維斯心肺研究所(OSU-DHLI)完成：1．研究EAT和腎周脂肪的特征：病理學(xué)方法包括：(1)蘇木精—伊紅染色：光學(xué)顯微鏡20×放大，觀察脂肪細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征；(2)透射電子顯微鏡：觀察脂肪細(xì)胞線粒體的超微結(jié)構(gòu),30，000×放大；(3)白色和棕色脂肪組織的特異性基因表達(dá)：用Trizol試劑提取EAT、腎周、肩胛間和內(nèi)臟脂肪的RNA，用分光光度儀測(cè)定RNA濃度，后逆

5、轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)。2．評(píng)價(jià)CAPs和（或）O3暴露后EAT和腎周脂肪的炎癥和氧化應(yīng)激：(1)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定脂肪組織上清液中脂聯(lián)素的水平；(2)實(shí)時(shí)定量PCR:檢測(cè)大氣污染物暴露對(duì)脂肪組織中白色和棕色脂肪標(biāo)志性基因表達(dá)的調(diào)控，以及多種炎癥基因的表達(dá)變化；(3)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)：半定量評(píng)價(jià)脂肪組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度；(4)免疫熒光染色技術(shù)：半定量評(píng)價(jià)誘導(dǎo)型—氧化氮合成酶(iNOS)熒光信號(hào)強(qiáng)

6、度；(5)蛋白質(zhì)提取和免疫印跡法分離純化蛋白質(zhì)：定量評(píng)價(jià)iNOS蛋白質(zhì)的表達(dá)；(6)透射電子顯微鏡檢查：觀察脂肪細(xì)胞線粒體的改變，定量分析線粒體的數(shù)目和面積變化。
　　 [結(jié)果]1．EAT和腎周脂肪均為白色脂肪：大體標(biāo)本呈白色；顯微鏡下見(jiàn)：?jiǎn)畏考?xì)胞、細(xì)胞核呈球形位于細(xì)胞邊緣、單個(gè)大脂滴、線粒體數(shù)目較棕色脂肪少，白色脂肪標(biāo)志性基因(Dpt和Hoxc9)表達(dá)與經(jīng)典的白色脂肪組織相近(p＞0.05)，而其棕色脂肪特異性基因（UCP1，

7、PGC-1α,Cidea,C/EBPβ和Dio2）表達(dá)低于棕色脂肪數(shù)百倍(p＜0.001)，以上符合白色脂肪特征。但EAT與其他內(nèi)臟白色脂肪明顯不同，脂肪細(xì)胞直徑較其他白色脂肪小5～10倍，UCP-1，PGC-1α和Cidea表達(dá)較其他白色脂肪高約10倍(p＜0.05)，提示EAT可能有棕色脂肪的某些特性。2．短期內(nèi)吸入性CAPs和（或）O3暴露，對(duì)心表面和腎周脂肪組織中的白色和棕色脂肪標(biāo)志性基因表達(dá)的調(diào)控，以及炎癥和氧化應(yīng)激作用：短期

8、的CAPs和（或）O3暴露，導(dǎo)致高果糖組大鼠的心表面和腎周脂肪組織中白色（Dpt和Hoxc9）和棕色脂肪(UCP1，PGC-1α和Cidea)的標(biāo)志性基因下調(diào)(p＜0.001)。致炎基因：各組中IL-6的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在HF組，TNF-α,MCP-1和leptin的表達(dá)呈明顯上調(diào)，HF-CAPs，HF-O3和HF-CAPs/O3vs.ND-AIR(p＜0.0001)；抗炎基因：IL-10和adiponectin表達(dá)呈明顯下調(diào)，H

9、F-CAPs，HF-O3和HF-CAPs/O3vs.ND-AIR(p＜0.05)。但在ND組內(nèi)比較，CAPs和O3暴露對(duì)EAT和腎周脂肪組織的基因調(diào)控，與HF組呈現(xiàn)相同趨勢(shì)，但ND-CAPs，ND-O3和ND-CAPs/O3vs.ND-AIR，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。免疫組織化學(xué)染色：大氣污染物暴露導(dǎo)致巨噬細(xì)胞在EAT和腎周脂肪組織中浸潤(rùn)明顯增加，HF-CAPs，HF-O3和HF-CAPs/O3vs.ND-AIR(p＜0.05

10、)。在ND組內(nèi)，CAPs和O3暴露后，巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎癥基因的上調(diào)有增加趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ND-CAPs，ND-O3和ND-CAPs/O3vs.ND-AIR(p＞0.05)；而HF組和ND-AIR比較則呈現(xiàn)明顯差異(p＜0.05)。氧化應(yīng)激作用：大氣污染物暴露后，iNOS免疫熒光信號(hào)強(qiáng)度和蛋白質(zhì)表達(dá)均增加，HF-CAPs，HF-O3和HF-CAPs/O3vs.ND-AIR，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。大氣污染物暴露導(dǎo)致

11、線粒體的面積明顯減少，ND-AIRvs.HF-CAPs，HF-O3和HF-CAPs/O3(p＜0.05)，線粒體的嵴減少、結(jié)構(gòu)模糊甚至破壞，但線粒體的數(shù)目無(wú)明顯減少，ND-AIRvs.HF-CAPs，HF-O3和HF-CAPs/O3，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。此外，本研究中多數(shù)實(shí)驗(yàn)顯示：HF組中單獨(dú)CAPs暴露較CAPs/O3混合暴露的致炎和氧化應(yīng)激作用更強(qiáng)。
　　 [結(jié)論]1.EAT和腎周脂肪均為白色脂肪，但EAT與其