菊花黃酮的提取純化及其對脂代謝紊亂大鼠作用的研究.pdf

1、目的：(1)研究提取菊花中黃酮類化合物的最佳工藝條件,得到菊花黃酮提取物。(2)探索適合對菊花黃酮進(jìn)行分離純化的方法條件,制備出純度較高的菊花黃酮。(3)分析鑒定該菊花黃酮的主要成分。(4)了解菊花黃酮是否能改善試驗大鼠的脂代謝紊亂狀態(tài)及可能的作用機(jī)制。 方法：(1)選用微波萃取法提取菊花黃酮,分別考察乙醇濃度、微波提取時間和料液比對菊花黃酮提取率的影響,在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計L9(34)正交優(yōu)化試驗,探討各影響因素綜合作

2、用條件下對提取率的影響,找出主、次影響因素和最佳組合條件參數(shù),得到提取率最高的條件來提取制備菊花黃酮。(2)通過預(yù)試驗及吸附特性,選取AB-8大孔吸附樹脂對菊花黃酮提取物進(jìn)行分離純化,分析此樹脂對菊花黃酮的靜態(tài)及動態(tài)吸附、解吸特性,通過改變洗脫劑濃度、上樣量和靜置吸附時間探索較好的分離純化條件,得到純度較高的菊花黃酮。(3)利用高效液相色譜(HPLC)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC/MS)、二級質(zhì)譜(MS/MS)等技術(shù)對得到的菊花黃

3、酮進(jìn)行分析,通過與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比對、質(zhì)譜進(jìn)行分子量及結(jié)構(gòu)分析,確定其中主要含有的黃酮類成分。(4)試驗大鼠分為陰性對照組、高脂模型對照組、菊花黃酮低劑量組、菊花黃酮中劑量組和菊花黃酮高劑量組5個組,陰性對照組飼料配方參照美國營養(yǎng)學(xué)會推薦的AIN-93M試驗動物合成飼料配方配制而成,該配方中的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)的含量是保證動物生長發(fā)育所必需的,在此基礎(chǔ)上適當(dāng)調(diào)整蛋白質(zhì)和蔗糖的比例,增加飽和脂肪含量,制成高脂飼料,除陰性對照組外其余各

4、組均飼以高脂飼料,受試物各組分別給予受試物菊花黃酮提取物25、50、100mg/bw·kg·d灌胃。連續(xù)喂養(yǎng)8周,測定各組大鼠體重,血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽圍醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、游離脂肪酸(NEFA)、脂蛋白脂酶(LPL)、載脂蛋白B(ApoB),取肝臟和主動脈弓作病理切片。取腎周脂肪組織,利用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法觀察各組大鼠脂肪組織中過氧化物增殖激活受體PPARγ的表達(dá)。

5、 結(jié)果：(1)單因素試驗結(jié)果表明：最佳萃取工藝參數(shù)為乙醇濃度60％,料液比1:20,提取時間120s。正交試驗結(jié)果表明,影響菊花黃酮微波提取的主要因素為乙醇濃度,其次為提取時間、料液比。最佳提取工藝條件為A2B3C2,即乙醇濃度60％,提取時間120s,料液比1:20。此時總黃酮提取率為4.83％,即選擇此條件作為提取菊花黃酮的條件。(2)AB-8大孔吸附樹脂可以有效地分離純化山粗提物中的黃酮成分。在20cm×2.5cm的層析柱上樣

6、10ml,以蒸餾水沖洗,并以30％乙醇進(jìn)行洗脫,收集洗脫液,在此條件下可獲得純度為84.5％的黃酮。(3)HPLC分析結(jié)果表明,樣品中絕大多數(shù)成分均屬黃酮類；此菊花黃酮類物質(zhì)中主要含有木犀草素-7-葡萄糖茁(luteolin-7-glucoside)這一黃酮苷,在該菊花中的含量約為0.4％；進(jìn)一步HPLC/MS分析發(fā)現(xiàn),還可能含有芹菜素-7-葡萄糖苷(apigenin-7-glucoside)、木犀草素(luteolin)等成分；通過M

7、S/MS正、負(fù)粒子條件下加電壓撞擊得到的結(jié)構(gòu)碎片分析證實確實還含有芹菜素-7-葡萄糖苷、木犀草素和芹菜素。(4)動物實驗結(jié)果表明,與高脂模型對照組相比,菊花黃酮受試物能降低脂代謝紊亂大鼠TG、TC、LDL-C、NEFA水平,升高血清HDL-C這一保護(hù)性因子水平,而且能夠明顯提高LPL活性,降低ApoB水平,減輕肝臟脂肪變性程度,減輕主動脈弓粥樣硬化程度,效果以菊花黃酮高劑量組最為明顯,而且從結(jié)果來看對膽固醇代謝的影響更好。同時RT-PC

8、R結(jié)果表明,菊花黃酮能增加脂肪組織中PPARγmRNA的表達(dá)水平,從而發(fā)揮對脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用。 結(jié)論：(1)微波萃取法,是一種新型高效的提取方法,與回流提取法相比,具有高效無污染等優(yōu)點(diǎn),有廣闊的發(fā)展前景。試驗證實其適合提取菊花中的黃酮成分,最佳提取工藝條件為乙醇濃度60％,提取時間120s,料液比1:20,提取率為4.83％。(2)AB-8大孔吸附樹脂可以有效地分離純化出粗提物中的黃酮成分,最佳條件為：在20cm×2.5cm

9、的層析柱上樣10ml,以蒸餾水沖洗,并以30％乙醇進(jìn)行洗脫,收集洗脫液,在此條件下可獲得純度為84.5％的黃酮。AB-8大孔吸附樹脂親和層析法可以較好地分離純化菊花黃酮粗提物中的黃酮類物質(zhì),該樹脂的吸附特性適合于分離菊花中的黃酮類成分,可得到較高純度的菊花黃酮,為進(jìn)一步分析及進(jìn)行功效試驗奠定了基礎(chǔ)。(3)按所述方法制備分離得到的成分絕大部分屬黃酮類,證實此提取純化方法是可行的。該品種菊花中確實含有菊花HPLC指紋圖譜中的木犀草素-7-葡