加減溫經(jīng)湯對寒凝血瘀大鼠免疫-神經(jīng)-生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和影響.pdf

1、加減溫經(jīng)湯是導(dǎo)師在總結(jié)多年臨床經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，由《婦人大全良方》溫經(jīng)湯化裁而來的治療寒凝血瘀婦科疾病的有效方劑。我們以寒凝血瘀大鼠作為研究對象，施加中藥加減溫經(jīng)湯進行干預(yù)。觀察寒凝血瘀大鼠生殖激素、神經(jīng)介質(zhì)和免疫因子的變化，以及加減溫經(jīng)湯對寒凝血瘀大鼠生殖激素、神經(jīng)介質(zhì)及免疫因子的影響。旨在從免疫-神經(jīng)-生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)方面探討寒凝血瘀婦科疾病的形成機理及加減溫經(jīng)湯的治療作用機制。 第一部分加減溫經(jīng)湯對寒凝血瘀大鼠生殖內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)和

2、影響 方法： 選擇清潔級健康SD雌性大鼠50只，鼠齡3個月，體重230±20g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機將其分為5組：即正常對照組(簡稱“正常組”)，模型對照組(簡稱“模型組”)，模型+溫經(jīng)湯低劑量組(簡稱“低劑量組”)，模型+溫經(jīng)湯高劑量組(簡稱“高劑量組”)，后2組合稱“治療組”，模型+桃紅四物湯組(簡稱“桃紅組”)，每組10只。 造模方法采用冰水冷凍的方法復(fù)制寒凝血瘀大鼠模型。治療低劑量組、高劑量組大鼠于造模

3、的第1天開始，分別按14.66g/kg、29.32g/kg給予加減溫經(jīng)湯灌胃，每日1次，連用2周；桃紅組按10.826g/kg/日給予桃紅四物湯灌胃，每日1次，連用2周；其它兩組給予同體積的蒸餾水灌胃。于2周后選擇動情間期稱重后斷頭處死大鼠。于實驗的第1天起，每日上午做陰道脫落細(xì)胞涂片1次，以5％的堿性美藍(lán)溶液染色，用普通光學(xué)顯微鏡觀察，判斷各組大鼠的動情周期。斷頭取血，離心，分離血清，分置，采用放射免疫分析法測定血清雌二醇(E2)、孕

4、酮(P)、睪酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)的含量。迅速剖取卵巢、子宮，剔除周圍組織，濾紙稍拭后，稱重，計算卵巢、子宮重量指數(shù)。左側(cè)卵巢、子宮以4％多聚甲醛固定，室溫下梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，制成3μm切片，HE染色，光鏡觀察卵巢、子宮組織形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果： 1一般情況觀察模型組大鼠受凍后開始出現(xiàn)寒戰(zhàn)，繼而表現(xiàn)蜷縮少動，反應(yīng)遲鈍，爪尾部紫暗，耳色暗紅，喜扎堆，呼吸微弱，被毛無光澤，飲水量

5、少，小便色清，大便溏瀉等癥狀。治療組高、低劑量組出現(xiàn)上述癥狀后很快減輕，恢復(fù)正常，桃紅組大鼠上述癥狀有不同程度的改善。 2陰道細(xì)胞涂片各組大鼠陰道涂片均顯示動情前期、動情期、動情后期、動情間期規(guī)律的周期性變化。動情周期：正常組4.3±0.48d，模型組5.5±0.97d，低劑量組5.1±1.11d，高劑量組4.3±0.48d，桃紅組5.2±0.92d。間期：正常組1.3±0.48d，模型組2.4±0.84d，低劑量組1.7±0.

6、67d，高劑量組1.5±0.53d，桃紅組2.1±0.57d。其中模型組大鼠動情周期延長，主要表現(xiàn)為間期延長，與正常組比較差異有顯著性(P＜0.01)；經(jīng)加減溫經(jīng)湯治療，低劑量組大鼠動情間期與模型組比較有所縮短(P＜0.05)，高劑量組大鼠動情周期和動情間期與模型組比較皆有所縮短(均P＜0.01)；桃紅組與模型組比較動情周期、動情間期有所縮短但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義；高劑量組與桃紅組比較動情周期、動情間期皆縮短，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0

7、.05)。高劑量組與低劑量組比較動情周期、動情間期皆縮短其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)。 3大鼠卵巢、子宮重量指數(shù)的變化 卵巢重量指數(shù)：正常組34.63±4.25mg/g，模型組31.72±4.07mg/g，低劑量組31.37±2.93mg/g，高劑量組32.88±4.85mg/g，對照組31.38±3.16mg/g。各組大鼠卵巢重量指數(shù)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 子宮重量指數(shù)：正常組182.22±42.16m

8、g/g，模型組187.01±50.28mg/g，低劑量組182.39±39.45mg/g，高劑量組210.38±21.03mg/g，桃紅組209.70±45.03mg/g。各組大鼠子宮重量指數(shù)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 4大鼠卵巢、子宮組織形態(tài)學(xué)的改變 卵巢組織形態(tài)學(xué)的改變：正常組大鼠卵巢形態(tài)正常，可見各期卵泡及其黃體組織；模型組卵巢可見各級卵泡但數(shù)量較少，未見成熟卵泡，血管管徑變細(xì)；低劑量組、高劑量組可見各級卵泡，血管基本

9、正常；桃紅組可見各級卵泡，但成熟卵泡較少。 第二部分加減溫經(jīng)湯對寒凝血瘀大鼠下丘腦神經(jīng)介質(zhì)的調(diào)節(jié)和影響 方法： 實驗動物分組、造模方法和給藥方法同第一部分。于兩周后選擇動情間期稱重后斷頭取腦，剝離硬腦膜后用手術(shù)刀片沿大腦皮層后緣與小腦前緣交界分離下丘腦組織，稱重，1/2下丘腦組織置生理鹽水中煮沸5分鐘，取出后迅速冷卻；研磨制成勻漿，用氫氧化鈉中和酸，離心，取上清液，采用放射免疫分析方法測定下丘腦中β-EP含量。另

10、1/2下丘腦組織加入預(yù)先冰冷的加入少量酸化正丁醇的玻璃勻漿器中，研磨制成勻漿，采用熒光分光光度法測定下丘腦中NE、DA、5-HT的含量。 結(jié)果： 1大鼠下丘腦β-EP含量 正常組74.81±3.68pg/mg，模型組105.13±20.57pg/mg，低劑量組89.51±7.97pg/mg，高劑量組76.52±6.82pg/mg，桃紅組90.63±5.90pg/mg。模型組大鼠下丘腦β-EP含量較正常組明顯升高，

11、有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，治療高、低劑量組大鼠下丘腦β-EP含量顯著降低(P＜0.01，P＜0.05)，高劑量組的治療效果明顯優(yōu)于低劑量組(P＜0.01)；桃紅組大鼠下丘腦β-EP含量較模型組顯著降低(P＜0.05)。治療高劑量組的治療效果明顯優(yōu)于桃紅組(P＜0.05)。 2大鼠下丘腦5-HT、NE、DA含量 下丘腦5-HT含量：正常組0.61±0.14μg/g，模型組0.99±0.07μg/g，低劑量

12、組0.76±0.08μg/g，高劑量組0.63±0.07μg/g，桃紅組90.63±5.90μg/g。模型組大鼠下丘腦5-HT含量較正常組明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，治療高、低劑量組大鼠下丘腦5-HT含量顯著降低(均P＜0.01)，高劑量組的治療效果明顯優(yōu)于低劑量組(P＜0.05)；桃紅組大鼠下丘腦5-HT含量較模型組顯著降低(P＜0.01)。治療高劑量組的治療效果明顯優(yōu)于桃紅組(P＜0.01)。 第三

13、部分加減溫經(jīng)湯對寒凝血瘀大鼠免疫調(diào)控的影響 方法： 實驗動物分組、造模方法和給藥方法同第一部分。斷頭處死大鼠，取血，離心，取血清分置，置于-20℃冰箱備檢。采用放射免疫分析法測定血清IL-1、IL-2、TNF-α的含量。迅速將卵巢組織置于4％多聚甲醛+0.1％DEPC溶液中固定，脫水、石蠟包埋，制作4μm厚切片，采用免疫組織化學(xué)SP法檢測卵巢組織IL-1、TNF-α蛋白表達(dá)。用彩色病理圖文分析系統(tǒng)分析IL-1、TNF-α

14、在卵巢組織切片中表達(dá)的平均灰度，以代表陽性信號的表達(dá)強度。最后進行組間比較。 結(jié)果： 1血清IL-1、IL-2、TNF-α放免檢測結(jié)果 血清IL-1含量：正常組0.20±0.05ng/ml，模型組0.12±0.02ng/ml，低劑量組0.14±0.03ng/ml，高劑量組0.19±0.03ng/ml，桃紅組0.15±0.05ng/ml。 血清IL-2含量：正常組4.43±0.74ng/ml，模型組3.12

15、±0.34ng/ml，低劑量組3.42±0.69ng/ml，高劑量組4.04±0.42ng/ml，桃紅組3.70±0.57ng/ml。 血清TNF-α含量：正常組0.53±0.09ng/ml，模型組0.70±0.06ng/ml，低劑量組0.66±0.10ng/ml，高劑量組0.55±0.11ng/ml，桃紅組0.59±0.04ng/ml。 2卵巢組織IL-1、TNF-α免疫組化測定 卵巢組織IL-1免疫組化測定：

16、正常組121.34±5.14，模型組103.11±4.74，低劑量組108.28±5.34，高劑量組116.04±6.43，桃紅組109.03±4.32。IL-1陽性表達(dá)定位于細(xì)胞漿內(nèi)，為棕黃色染色。在大鼠卵巢顆粒細(xì)胞、黃體細(xì)胞、卵泡液中均有表達(dá)，在髓質(zhì)血管周圍有少量表達(dá)。模型組大鼠卵巢組織IL-1表達(dá)增強，與正常組比較其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；經(jīng)溫經(jīng)湯治療后，高劑量組卵巢組織IL-1表達(dá)減弱，與模型組比較其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

17、P＜0.01)；高劑量組卵巢組織IL-1的表達(dá)較低劑量組、桃紅組減弱，比較其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)。 結(jié)論 1加減溫經(jīng)湯能促進寒凝血瘀大鼠卵巢發(fā)育，改善卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)血清E2、P、T、LH、FSH水平，從而調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌功能。 2加減溫經(jīng)湯能調(diào)節(jié)寒凝血瘀大鼠下丘腦β-EP、5-HT、NE、DA分泌釋放，調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌功能。 3加減溫經(jīng)湯能夠調(diào)節(jié)寒凝血瘀大鼠血清IL-1、IL-2、TN