scrAAV8-Kallistatin治療肝癌臨床前藥效學(xué)研究.pdf

1、原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）簡(jiǎn)稱肝癌，發(fā)病率和死亡率都很高惡性腫瘤之一，傳統(tǒng)抗癌藥物普遍存在藥效短、見效慢、需要多次給藥的問題，而基因治療帶來了新希望。重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）載體因其具有在體內(nèi)外長(zhǎng)期高效表達(dá)、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床試驗(yàn)并取得了良好療效。此外，與研究較深入的單鏈AAV2相比，AAV8具有免疫原

2、性低、肝臟靶向性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，自身互補(bǔ)型AAV（self-complementary AAV，scAAV）具有高效快速表達(dá)的特點(diǎn)，因而scrAAV8被認(rèn)為是肝臟相關(guān)疾病基因治療最具前景的載體。
　　Kallistatin（KAL），一種內(nèi)源性血管生成抑制因子，不僅能抑制血管生成、血管舒張，還具有顯著的抗氧化、抗炎癥及抗腫瘤的多重功效。研究表明，ssrAAV2-KAL可顯著抑制肝癌的增殖，本研究以 scrAAV2-KAL做比較，探討sc

3、rAAV8-KAL在體內(nèi)外對(duì)肝癌治療作用，尋求一種更安全有效、靶向性更強(qiáng)的肝癌治療基因藥物，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。scrAAV-KAL抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激和抗血管生成作用分三部分進(jìn)行如下研究：
　　本研究首先選取易于定量檢測(cè)的Gaussia luciferase（Gluc）作為報(bào)告基因，制備兩種參比scrAAV2/8-Gluc，同時(shí)生產(chǎn)自身互補(bǔ)型scrAAV2/8/9-KAL和單鏈ssrAAV8-KAL四種基因藥物，以 HUVEC、人

4、源肝（癌）細(xì)胞為研究對(duì)象，對(duì)rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率進(jìn)行篩選。Elisa檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清中KAL的表達(dá)，scrAAV8在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，與scrAAV8相比，scrAAV9在多數(shù)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低，ssrAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高，scrAAV2在HUVEC、肝正常細(xì)胞高表達(dá)；
　　體外檢測(cè)基因藥物對(duì)HUVEC、肝（癌）細(xì)胞增殖、周期的影響，結(jié)果表明其對(duì)肝正常細(xì)胞沒有明顯影響，但是提高 HepG2肝癌細(xì)胞 S期比例，明顯抑制 HUVEC/SM

5、MC-7721細(xì)胞活力，將細(xì)胞周期阻滯在 G0/G1期；劃痕法、Western Blot和小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：scrAAV8組可以明顯抑制SMMC-7721遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，四種藥物均能抑制HUVEC小管形成能力；
　　基因藥物預(yù)處理可以提高氧化應(yīng)激損傷后HUVEC、HepG2細(xì)胞活力、ROS水平和超氧化物岐化酶 SOD、谷胱甘肽還原酶 GSH-px活性、總抗氧化能力，抑制乳酸脫氫酶LDH釋放；
　　本研究最后進(jìn)行體內(nèi)藥

6、效學(xué)實(shí)驗(yàn)，不同免疫背景小鼠（Balb/c、C57BL/6）體內(nèi)以不同血清型、劑量、給藥途徑給藥，36周后血清中 KAL依然高表達(dá)，scrAAV8尾靜脈注射組的血清以及肝臟內(nèi) kal表達(dá)量最高?；蛩幬飳?duì) HepG2肝癌皮下移植瘤的增殖、侵襲具有抑制作用，scrAAV8-Kal作用大于scrAAV2-Kal。
　　基因藥物可以選擇性殺傷HUVEC、腫瘤細(xì)胞，抑制其增殖、遷移，對(duì)肝正常細(xì)胞沒有顯著作用，并通過抗氧化應(yīng)激作用保護(hù)細(xì)胞，s