乙型肝炎病毒DNA在人卵母細(xì)胞和胚胎中的整合及HBV感染婦女ART結(jié)局的研究.pdf

1、背景:
　　 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是一種引起乙型肝炎(haepaltitiS B)的嗜肝性病毒。全球有20多億人有乙型肝炎病毒感染史,其中約有3.5億人為HBV的慢性攜帶者,HBV的感染與80％的原發(fā)性肝細(xì)胞癌具有相關(guān)性,每年約有100多萬人死于因HBV感染引起的嚴(yán)重肝臟疾病。我國是乙型肝炎高發(fā)區(qū),1-60歲人群中HBsAg陽性率為7.2％,其中處在婚育年齡人群乙肝病毒攜帶率近10％。

2、>　　 乙型肝炎病毒廣泛存在于乙肝患者的體液中,如唾液、淚液、汗液、乳汁、精液、內(nèi)分泌液和血液。血清HBeAg、HBV-DNA和Pre-S1均是反應(yīng)乙肝病毒復(fù)制或傳染性的重要指標(biāo),在HBV感染早期,具有較高的一致檢出率,然而HBVDNA是復(fù)制活動最直接和可靠的指標(biāo)。傳播渠道多樣化:輸血、性交、醫(yī)源性及密切的生活接觸等水平傳播和父嬰、母嬰之間的垂直傳播(vertical transmission)。垂直傳播是HBV傳播的主要途徑之一,其

3、可分為母嬰傳播和父嬰傳播。母嬰垂直傳播可分為3個水平:產(chǎn)前傳播、產(chǎn)時(shí)傳播及產(chǎn)后傳播。產(chǎn)前傳播可分為經(jīng)胎盤傳播(transplacental transmission)和經(jīng)生殖細(xì)胞(generative cells)傳播。近年來,經(jīng)過適當(dāng)?shù)闹鲃?、被動?lián)合免疫干預(yù),能夠有效阻斷多數(shù)HBV的感染,但仍然有約10％的嬰兒阻斷失敗。研究發(fā)現(xiàn)在人類生殖腺及生殖細(xì)胞如睪丸,精子、精漿以及卵巢中的顆粒細(xì)胞、卵細(xì)胞中有HBV的存在和表達(dá),從而使得乙型肝炎

4、病毒經(jīng)生殖細(xì)胞進(jìn)行垂直傳播的學(xué)說得以發(fā)展。
　　 乙型肝炎病毒亦可影響人類生殖能力。HBV感染可以通過全身或局部的免疫作用、病毒基因的整合干擾基因組正常機(jī)能以及肝炎病毒蛋白表達(dá)影響精子的產(chǎn)生、導(dǎo)致形態(tài)和活力的改變,從而降低人類生殖能力。隨著人類輔助生殖技術(shù)日益進(jìn)步、人類生活模式變化以及環(huán)境的影響,越來越多的人接受輔助生殖技術(shù)助孕治療,其中不乏有乙型肝炎攜帶不孕夫婦。在這一領(lǐng)域中,病毒感染影響輔助生殖技術(shù)治療結(jié)局的問題引起人們的關(guān)

5、注。然而,HBV感染是否降低輔助生殖治療的結(jié)局?目前尚未有一致的觀點(diǎn)。
　　 本課題擬研究乙型肝炎病毒攜帶患者血清和卵泡液中病毒載量的關(guān)系;體內(nèi)病毒復(fù)制狀態(tài)與發(fā)生經(jīng)卵母細(xì)胞垂直傳播的關(guān)系;女性乙肝病毒攜帶者血清和卵泡液中病毒含量與輔助生殖治療結(jié)局的關(guān)系,為臨床對HBV攜帶患者開展ART治療提供理論依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 收集2009年2月～2009年12月在浙江大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖內(nèi)分泌科接受常規(guī)體外

6、受精/卵胞漿單精子注射.胚胎移植治療的176例乙肝病毒攜帶婦女的血清和卵泡液;176例中的106例乙肝病毒攜帶婦女廢棄的卵母細(xì)胞206個及胚胎441個。采用熒光定量PCR方法檢測血清與卵母細(xì)胞的:HBV DNA濃度,用HBV DNA全長作為探針采用原位雜交方法(Fluorescence in sire hybridization,FISH)檢測HBVDNA在胚胎和卵母細(xì)胞中的整合。通過統(tǒng)計(jì)軟件分析血清和卵泡液中病毒載量與發(fā)生HBV DN

7、A在卵母細(xì)胞和胚胎中整合的關(guān)系。同時(shí)選擇2006年01月-2009年12月在本中心接受體外受精助孕治療的513對女性乙肝病毒攜帶不孕夫婦的557個周期作為暴露組。以女方年齡(年齡±1)、取卵時(shí)間(天數(shù)±1)以及ART受精方式(IVF和ICSI)作為匹配條件,利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件隨機(jī)抽取1:1本院同年的,夫婦雙方均為乙肝陰性周期作為非暴露組。兩組建立回顧性隊(duì)列,分析女方乙肝攜帶對于著床率(孕囊數(shù)/ET胚胎數(shù))、臨床妊娠率(超聲證實(shí)為宮內(nèi)孕

8、婦女?dāng)?shù)/完成移植周期數(shù))、流產(chǎn)率(發(fā)生流產(chǎn)婦女?dāng)?shù)/宮內(nèi)孕婦女總數(shù)),分娩數(shù)(完成分娩婦女?dāng)?shù)/完成胚胎移植周期數(shù))以及周期得孩率(活產(chǎn)胎兒數(shù)/ART啟動周期數(shù)),同時(shí)分析女性體內(nèi)病毒復(fù)制狀態(tài)如HBeAg血清狀態(tài)、血清病毒拷貝數(shù)及卵泡液中病毒含量對于ART結(jié)局的影響。
　　 結(jié)果:
　　 血清中HBV DNA陽性檢出率為54.4％,卵泡液可檢測到乙肝病毒DNA,陽性率為45.7％;多數(shù)血清中HBV DNA含量高于卵泡液(P＜

9、0.05),然而少部分患者其卵泡液中病毒含量較血清中高。線性相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)血清和卵泡液間乙肝病毒DNA含量存在中等強(qiáng)度正相關(guān),(R=0.427,P=0.001)。卵母細(xì)胞內(nèi)HBV DNA整合信號的陽性率為8.25％,早期胚胎內(nèi)的陽性率為12.92％;HBeAg陽性組卵母細(xì)胞的HBV DNA陽性率顯著高于HBeAg陰性組(14.8％VS4.5％,P＜0.05),前者胚胎的陽性率較后者有增高趨勢(17.1％VS10.6％,P=0.051);血

10、清HBV DNA＞106組胚胎及卵母細(xì)胞中HBV DNA整合的陽性率顯著高于HBV DNA＜106組(P＜0.05);卵泡液中HBVDNA＞105組胚胎及卵母細(xì)胞中HBV DNA整合的陽性率顯著高于HBV DNA＜105組(P＜0.05);著床率、臨床妊娠率、以及周期得孩率陽性組較陰性對照組稍低而流產(chǎn)率稍增加,但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),活胎分娩周期在陽性組中顯著低于對照組(P＜0.05);HBV DNA＞105病人流產(chǎn)率HBV

11、 DNA＜105組顯著性增加,周期得孩率顯著性降低(P＜0.05);卵泡液HBV DNA陽性組的著床率、臨床妊娠率、活胎分娩周期以及周期得孩率較陰性組顯著性降低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、乙型肝炎病毒攜帶患者卵泡液中存在乙肝病毒的復(fù)制;
　　 2、進(jìn)一步驗(yàn)證乙肝病毒DNA可整合到人卵母細(xì)胞和胚胎中;
　　 3、卵泡液中的HBV DNA含量多數(shù)較血清中低,兩者存在中等程度的正相關(guān);
　

12、　 4、血清HBeAgN性病毒在卵母細(xì)胞中的整合率顯著增高;
　　 5、血清HBV DNA＞1.0×106拷貝/毫升,卵跑液中HBv DNA濃度≥1.0×105持貝毫升時(shí)病毒在卵母細(xì)胞及胚胎中的整合率顯著增高;
　　 6、乙肝攜帶狀態(tài)對婦女卵巢儲備能力以及卵巢對促排卵治療的反應(yīng)性無影響;
　　 7、女方乙肝攜帶夫婦經(jīng)體外受精胚胎移植治療后最終獲得活胎分娩的周期較陰性對照組有顯著性降低;
　　 8、女方血