乙酰肝素酶和SDF-1-CXCR4生物學(xué)軸在乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、目的：
　　 乙酰肝素酶（Heparanase，HPSE）是體內(nèi)唯一可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（Heparan sulfate proteoglycan，HPSG）一種葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，可促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）及其受體CXCR4參與許多病理生理過(guò)程，包括引起腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生趨化運(yùn)動(dòng)，而腫瘤細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)與腫瘤體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系。細(xì)胞外基質(zhì)的降解和腫瘤細(xì)胞的定向運(yùn)動(dòng)是腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移

2、兩個(gè)重要過(guò)程，研究顯示乙酰肝素酶高表達(dá)與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，SDF-1/CXCR4生物學(xué)軸的激活在乳腺癌向特定組織器官轉(zhuǎn)移的過(guò)程中也起到關(guān)鍵作用，但乙酰肝素酶與SDF-1/CXCR4生物學(xué)軸在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中是否存在協(xié)同作用尚無(wú)人探討。本研究采用免疫組化及RT-PCR方法聯(lián)合檢測(cè)乙酰肝素酶、SDF-1、CXCR4在乳腺浸潤(rùn)癌、導(dǎo)管原位癌、癌旁組織中的表達(dá)，旨在明確乙酰肝素酶和SDF-1/CXCR4生物學(xué)軸在乳腺癌生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中

3、的作用，探討兩者的相關(guān)性。
　　 方法：
　　 1、材料
　　 乳腺浸潤(rùn)癌、乳腺導(dǎo)管原位癌及癌旁組織均取自沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院2002年9月-2007年12月手術(shù)切除標(biāo)本，其中免疫組化方法檢測(cè)標(biāo)本經(jīng)10％中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，RT-PCR方法檢測(cè)標(biāo)本新鮮組織立即放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 2、免疫組化
　　 免疫組織化學(xué)染色采用SP法，將石蠟包埋的組織制成4 μm厚的切片，常規(guī)二甲苯

4、脫蠟，梯度酒精水化；修復(fù)抗原；滴加SP法檢測(cè)試劑（具體操作按照說(shuō)明書進(jìn)行）；乙酰肝素酶、SDF-1和CXCR4抗體均按1:100倍稀釋；PBS代替一抗做陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性切片做陽(yáng)性對(duì)照；4℃過(guò)夜；AEC顯色5-10min；蘇木素復(fù)染；AEC封片膠及中性樹膠封片。
　　 3、RT-PCR
　　 總RNA提取過(guò)程嚴(yán)格按照RNAiso Plus試劑說(shuō)明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程也按試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。循環(huán)條件為：94℃預(yù)變性3 min

5、，94℃變性30 s，53.5℃、59.5℃、56.5℃、58.5℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)后于72℃延伸5 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物的大小分別是288bp（HPSE）、366 bp（CXCR4）、124 bp（SDF-1）和224 bp（GAPDH），PCR產(chǎn)物經(jīng)EB染色，2％瓊脂糖凝膠電泳，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。采圖并經(jīng)Image J軟件進(jìn)行灰度定量分析。
　　 4、統(tǒng)計(jì)分析
　　 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13

6、.0統(tǒng)計(jì)軟件，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、免疫組化
　　 乙酰肝素酶、SDF-1及CXCR4在乳腺浸潤(rùn)性癌與導(dǎo)管原位癌，導(dǎo)管原位癌與癌旁組織中的表達(dá)兩兩比較均有差異（P<0.05），三者在乳腺浸潤(rùn)性癌中的表達(dá)呈正相關(guān)（P<0.05），其中乙酰肝素酶和CXCR4表達(dá)與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期有關(guān)（P<0.05）。
　　 2、RT-PCR
　　 乙酰肝素酶mRNA在乳腺浸潤(rùn)

7、性癌與導(dǎo)管原位癌，乳腺浸潤(rùn)癌與癌旁組織中的表達(dá)兩兩比較均有差異（P<0.05），導(dǎo)管原位癌與癌旁組織的表達(dá)無(wú)差異（P>0.05），SDF-1與CXCR4mRNA在乳腺浸潤(rùn)性癌與導(dǎo)管原位癌，導(dǎo)管原位癌與癌旁組織中的表達(dá)兩兩比較均有差異（P<0.05），三者mRNA在乳腺浸潤(rùn)性癌中的表達(dá)呈正相關(guān)（P<0.05）
　　 結(jié)論：
　　 乙酰肝素酶和SDF-1/CXCR4生物學(xué)軸在促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中均起到重要促