復方紫金肝泰抗HBV物質(zhì)基礎(chǔ)的研究.pdf

1、復方紫金肝泰是由紫紅獐牙菜(SwertiapuniceaHemsl)和雞內(nèi)金組方研究而成的中藥新藥，以紫紅獐牙菜為君藥。為了闡明復方紫金肝泰治療乙型肝炎的物質(zhì)基礎(chǔ)，本課題從體外抗乙型肝炎病毒(HBV)活性方面對紫紅獐牙菜的有效部位、活性成分和雞內(nèi)金的有效酶解產(chǎn)物進行了較系統(tǒng)的研究，并建立了紫紅獐牙菜及其近緣種中多種活性成分含量測定的方法以及紫紅獐牙菜藥材的指紋圖譜。 將紫紅獐牙菜乙醇提取物(SP)分散于水中，用石油醚、乙醚、乙酸

2、乙酯分別萃取，得到石油醚提取物(F1-SP)、乙醚提取物(F2-SP)、乙酸乙酯提取物(F3-SP)和水溶性部位(F4-SP)，再用AB-8型大孔吸附樹脂富集水溶性部位中的苷類等成分，得純化后的水溶性部位(F'4-SP)。用乙型肝炎病毒(HBV)DNA轉(zhuǎn)染人肝癌細胞(HepG2)的2215細胞系篩選有效部位，以觀察細胞病變(CPE)為指標測定藥物毒性，用固相放射免疫法(RIA法)測定2215細胞分泌的HBsAg、HBeAg。其中水溶性部

3、位(F4-SP、F'4-SP)毒性較小，兩者TC50均大于2000μg/ml；乙酸乙酯提取物(F3-SP)為體外抗HBV的有效部位，其對HBsAg、HBeAg的半數(shù)毒性濃度(IC50)分別為58μg/ml、100μg/ml，選擇指數(shù)(SI)分別為12.2、7.1，并且多數(shù)濃度組對HBsAg、HBeAg抑制率與細胞對照組比較均有顯著性差異(P＜0.05)。從而篩選出紫紅獐牙菜抗HBV的有效部位。 從F4’-SP進一步分離得到4個單

4、體化合物，經(jīng)理化性質(zhì)和UV、IR、1HNMR、13CNMR、HMQC、HMBC及MS等波譜數(shù)據(jù)分析，分別鑒定為芒果苷(mangiferin，1，3，6，7-四羥基口山酮-2-C-β-吡喃葡萄糖苷，Ⅰ)、獐牙菜苦苷(swertiamarin,Ⅱ)、當藥醇苷(swertianolin，8-O-β-D-吡喃葡萄糖-1，5-二羥基-3-甲氧基口山酮，Ⅲ)及葡萄糖(glucose，Ⅳ)。從F3-SP進一步分離得到5個單體化合物，分別鑒定為1，7，

5、8-三羥基-3-甲氧基口山酮(swertianin,Ⅴ)、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基口山酮(Ⅵ)、1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山酮(bellidifolin,Ⅶ)、5-O-β-D-吡喃葡萄糖-1，8-二羥基-3-甲氧基口山酮(Ⅷ)及齊墩果酸(oleanolicacid，Ⅸ)，其中化合物Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ為首次從紫紅獐牙菜植物中得到?；衔铫?、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ對培養(yǎng)8d的2215細胞的HBsAg表達有抑制作用，IC50分別為432μg/ml、

6、30μg/ml、13μg/ml、12.4μg/m1，SI分另為1.16、2.1、6.8、14.2；化合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅷ對2215細胞的HBeAg表達有抑制作用，IC50分別為88.5μg/ml、8.0μg/ml、8.72μg/ml、18.67μg/ml,SI分別為4.5、6.2、2.36、6.76。以上化合物對2215細胞DNA均無明顯的抑制作用。從而確定了紫紅獐牙菜抗HBV的主要活性成分。 雞內(nèi)金在胰蛋白酶(amylopsin

7、，Ⅰ)、木瓜蛋白酶(papain，Ⅱ)及中性蛋白酶(neutralproteinase，Ⅲ)的作用下均能水解，但水解率有差別，在胰蛋白酶作用下水解率較高。通過正交試驗[L9(34)]優(yōu)選出胰蛋白酶最佳酶解條件為：酶濃度0.8％、底物濃度2％、反應溫度50℃、反應時間4.5h(B1C3D2A3)；木瓜蛋白酶最佳酶解條件為：酶濃度0.4％、底物濃度2％、反應溫度40℃、反應時間4.5h(B1D2C2A1)；中性蛋白酶最佳酶解條件為：酶濃度0

8、.8％、底物濃度2％、反應溫度35℃、反應時間4h(B1A3C1D1)。氨基酸含量分析結(jié)果提示三種酶的水解氨基酸種類基本一致，除胰蛋白酶酶解產(chǎn)物中不含胱氨酸(Cys)，均含天門冬氨酸(Asp)等16種水解氨基酸；三種酶的水解氨基酸含量有差別，在正交試驗中的相同條件(A3B1C3D2)下胰蛋白酶水解后水解氨基酸總量較高，為146.52mg/100ml。分別選擇三種酶酶解產(chǎn)物中酶解率高、中、低三種產(chǎn)物經(jīng)2215細胞篩選，九種供試藥物中胰蛋白

9、酶7號試驗產(chǎn)物(I7)對培養(yǎng)8d的2215細胞分泌的HBsAg和HBeAg有抑制作用，IC50分別為855μg/ml、744μg/ml，IS分別大于4.68、5.38，且對HBsAg、HBeAg抑制率呈量效關(guān)系；中性蛋白酶8號試驗產(chǎn)物(Ⅲ8)對培養(yǎng)4d的2215細胞分泌的HBsAg有抑制作用，IC50為706.2μg/ml，SI為5.66。從而確定了雞內(nèi)金酶解產(chǎn)物中具抗HBV作用的酶解產(chǎn)物。 采用HPLC色譜法測定了紫紅獐牙菜不

10、同藥用部位及7個近緣種中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、8-o-β-D-吡喃葡萄糖基-1，5-二羥基-3-甲氧基口山酮、1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山酮等活性成分的含量。結(jié)果表明紫紅獐牙菜不同藥用部位及近緣種間活性成分含量具有明顯差異，從而為紫紅獐牙菜及其近緣種的質(zhì)量控制提供了一定的依據(jù)。 采用HPLC色譜法建立了復方紫金肝泰的君藥紫紅獐牙菜藥材的指紋圖譜，并歸屬了主要活性成分的指紋峰，1號峰為獐牙菜苦苷，2號峰為龍膽苦苷，7