基于精密肝切片技術(shù)的何首烏致肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：
　　采用精密肝切片技術(shù)探討何首烏致肝毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　生何首烏經(jīng)乙醇提取后，提取液回收至無醇味，浸膏加水分散至一定體積，再依次經(jīng)乙酸乙酯和正丁醇萃取，分別回收溶劑后得到乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水部位。
　　將上述的乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水部位分別與肝切片共同培養(yǎng)6 h后制備肝組織勻漿，勻漿液中的蛋白含量采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）法進(jìn)行檢測

2、，連續(xù)監(jiān)測法測定并計算每微克蛋白中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase, ALT），天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase, AST），γ-谷氨酰氨基轉(zhuǎn)肽酶（gamma-glutamine amino transpeptidase, GGT）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）的漏出率，通過酶漏出率的大小篩選毒性部位，酶泄漏率越高說明該部位

3、的肝毒性越大。
　　利用硅膠、ODS、MCI柱層析、Sephadex LH-20、PHPLC、TLC等各種色譜技術(shù)對何首烏毒性部位的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，并通過 MS、NMR等波譜分析及與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行薄層比對的方法鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。
　　運用噻唑藍(lán)比色法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）檢測何首烏中游離蒽醌、結(jié)合蒽醌及萘類共11個單體成分對HepG2細(xì)胞的毒性，篩選出有肝細(xì)胞毒性的化合物，并

4、進(jìn)行相應(yīng)的構(gòu)效關(guān)系分析；采用精密肝切片（precision-cut liver slices,PCLS）技術(shù)對有細(xì)胞毒性的化合物進(jìn)行驗證，探討何首烏導(dǎo)致肝毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　結(jié)果：
　　何首烏3個不同的萃取部位分別與肝切片共同培養(yǎng)6 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位0.4 g·mL-1組能引起肝切片ALT，AST，GGT，LDH漏出率的顯著升高（P<0.01或P<0.05），0.2 g·mL-1能引起肝切片ALT，GGT，LDH漏

5、出率的顯著升高（P<0.05或P<0.01）。相對于同等濃度下的正丁醇及水部位酶漏出率較大，毒性較強。因此，采用色譜技術(shù)對乙酸乙酯部位的化合物進(jìn)行了分離純化并鑒定出6個化學(xué)成分，分別為大黃素、ω-羥基大黃素、大黃素甲醚-8-O-(6′-O-乙?；?-β-D-葡萄糖苷、沒食子酸、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷及大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷。
　　MTT試驗結(jié)果顯示大黃酸、大黃素、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素

6、甲醚-8-O-(6′-O-乙酰基)-β-D-葡萄糖苷的IC50值分別為71.07，125.62，242.27，402.32μM，而其他7個化合物的毒性很小。采用PCLS技術(shù)對肝細(xì)胞毒性較強的成分大黃酸、大黃素及大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷的肝毒性進(jìn)行進(jìn)一步的驗證，結(jié)果顯示大黃酸400μM組能引起肝切片ALT，AST，LDH漏出率的顯著升高（P<0.01），100μM能引起肝切片LDH漏出率的顯著升高（P<0.05）；隨藥物濃度增

7、大，蛋白含量顯著下降（P<0.05），且顯示一定的量毒關(guān)系。大黃素400μM組可引起肝切片ALT，GGT， LDH漏出率的顯著升高（P<0.01）。大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷800μM能引起肝切片ALT，AST，LDH漏出率的顯著升高（P<0.01或P<0.05）；200μM能引起肝切片LDH漏出率的顯著升高（P<0.05），且隨藥物濃度的增大肝切片ALT，AST，LDH漏出率呈升高趨勢、蛋白含量呈下降趨勢。濃度為800μM的