周期性靜水壓對人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞活性的時間依賴性影響.pdf

1、骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種常見、多發(fā)的退行性病變,但病因迄今尚不明確。現(xiàn)認為是通過一個復(fù)雜的遺傳,代謝,生化和生物力學(xué)因素的相互作用,激活炎癥反應(yīng),包括軟骨、軟骨下骨、滑膜的作用,從而誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨損傷。主要與軟骨細胞營養(yǎng)代謝、細胞外基質(zhì)(extra cellular matrix,ECM)異常降解、生物力學(xué)平衡有關(guān)。
　　經(jīng)過軟骨ECM傳導(dǎo)壓力,軟骨細胞暴露于各種各樣的生物、力學(xué)信號。OA是一個多因素疾病

2、,導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨降解的過程比預(yù)期的更加復(fù)雜,分析單獨一個因素的影響是非常困難的。但可以確定的是生物力學(xué)的加載對維持軟骨的穩(wěn)態(tài)是非常必要的。在關(guān)節(jié)軟骨的生長發(fā)育中,生理性的生物應(yīng)力刺激起到關(guān)鍵作用。軟骨中力學(xué)因素刺激的相互作用,及其在正常和病理條件下對細胞和組織之間的調(diào)節(jié)機制目前尚未完全明確。ILs與MMPs家族是參與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病進程的重要炎性因子。軟骨細胞通過力學(xué)信號結(jié)合其基因表達來調(diào)控膠原、蛋白多糖、炎性因子的分泌。
　　MiRN

3、A是一種大小約22個堿基左右的單鏈非編碼小分子RNA,通過調(diào)節(jié)互補靶mRNA的表達和影響其翻譯成蛋白來負調(diào)控基因表達。miRNA在軟骨形成的過程和軟骨重塑中對所有細胞調(diào)控都是至關(guān)重要的作用。miRNA的異常表達譜已被證明是與OA的發(fā)展密切相關(guān)的。
　　本研究以正常和OA人群為研究對象,模擬體內(nèi)環(huán)境,構(gòu)建循環(huán)靜水加壓模型,研究不同強度、不同時間的周期性靜水壓對正常和OA人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞的生物學(xué)影響,比較之間的差異性。
　　目的

4、:為軟骨細胞體外培養(yǎng)及建立組織工程軟骨提高效率和成功率,摸索一定生理范圍壓力刺激的合適時間參數(shù),提供理論實驗依據(jù)。同時為探索OA生物力學(xué)因素的發(fā)病機理奠定一定的實驗基礎(chǔ)。
　　方法:一:原代軟骨細胞體外分離培養(yǎng);甲苯胺藍、Ⅱ型膠原免疫細胞化學(xué)染色鑒定;MTT法分析軟骨細胞生長曲線;建立靜水壓加載模型。
　　二:正常軟骨細胞分四組,2MPa加壓0h、4h、8h、12h,Ⅱ型膠原免疫細胞化學(xué)染色半定量分析;MTT法分析各組細胞生

5、長曲線;流式細胞儀檢測各組細胞凋亡。
　　三:正常軟骨分為10MPa2h加壓組和對照組,OA軟骨為OA組,檢測加壓5天后IL-1β、MMP-3、GAG含量;正常軟骨細胞分四組,2MPa加壓0h、4h、8h、12h,5天后檢測IL-1β、MMP-3、GAG含量。
　　四:實時定量PCR檢測加壓10MPa組、2MPa4h組、8h組、12h組以及對照組6組細胞mir-21的表達水平;轉(zhuǎn)染has-mir-21 mimics檢測軟骨細

6、胞的增殖、凋亡和Ⅱ型膠原的表達。
　　結(jié)果:一:軟骨細胞生長曲線呈“S”形,1-3天增殖較慢,5-8天增殖明顯,指數(shù)增長。8天達到平臺期,并趨于下降。
　　二:2MPa靜水壓,各加壓組的軟骨細胞II型膠原含量增加,細胞增殖加快,凋亡率下降,尤其以8h組最為顯著。
　　三:1.OA組、10MPa加壓組與對照組IL-1β與MMP-3含量間存在正相關(guān)關(guān)系。OA組細胞中IL-1β、MMP-3含量高于加壓組和對照組,加壓組IL-

7、1β與MMP-3水平高于對照組。加壓組GAG濃度出現(xiàn)明顯下降,且早期下降更為顯著。2.2MPa加壓時間分組:對照組IL-1β含量(5.06±0.08pg/ml)、MMP-3含量(5.33±0.74ng/ml)最多,8h組IL-1β含量(3.79±0.32pg/ml)、MMP-3含量(2.89±0.37ng/ml)最少。8h組GAG含量(452.80±19.96ug/ml)最多,對照組GAG含量(245.70±17.57ug/ml)最少。

8、
　　四:1.實時定量PCR分析,6組細胞mir-21表達水平有明顯差異。OA組最高,其次是10MPa組,2MPa三個時間組都小于對照組。2.轉(zhuǎn)染mir-21mimics后軟骨細胞增殖速率受到抑制而降低,軟骨細胞凋亡率(23.63±3.38％)升高,II型膠原蛋白的表達明顯減少。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建軟骨細胞體外培養(yǎng)靜水壓加壓模型;2MPa壓力刺激8h有利于增強軟骨細胞增殖活力,降低細胞凋亡率,促進COL-II、GAG的分泌;