用于尿微量白蛋白檢測的抗體微陣列構(gòu)建.pdf

1、目的：充分利用蛋白質(zhì)組學之新穎技術(shù)——抗體微陣列（也稱抗體芯片）的高靈敏度、高特異性、高通量等優(yōu)勢，探討基于直接標記法的尿微量白蛋白檢測抗體微陣列的構(gòu)建方法，優(yōu)化實驗步驟，并初步評價其技術(shù)可行性和臨床實用價值。 方法：通過玻片處理、活化、固定等程序構(gòu)建白蛋白抗體芯片，摸索用NHS-生物素標記標準品白蛋白及尿液樣本的最佳條件，經(jīng)封閉后加入生物素標記的標準品白蛋白，孵育、洗滌后加入鏈酶親和素-Cy3，再經(jīng)過孵育、洗滌后用共聚焦激光掃

2、描儀獲取熒光強度值，根據(jù)不同濃度標準品白蛋白的相對信號強度值做出濃度-信號強度曲線，并評價其檢測靈敏度、特異性、重復性。收集臨床糖尿病患者尿液標本，對尿液樣本同時行免疫比濁法和抗體芯片法檢測白蛋白值，將兩種方法檢測值行相關(guān)性分析。 結(jié)果：針對目標抗原為白蛋白的生物素標記樣本，總蛋白/生物素質(zhì)量比為2：1時標記效果最佳；在其他條件相同情況下比較不同孵育溫度對樣本標記效果的影響，孵育溫度為37℃時較0℃、4℃和25℃更能獲得理想的檢

3、測信號；標記后的樣本立即行免疫分析檢測與存放24小時和1周后檢測的信號無明顯差異；根據(jù)標準品白蛋白所做出的標準曲線其R2可達0．9979；捕獲抗體濃度為1mg/ml時最低白蛋白檢測濃度為0．05ug/ml；特異性檢測提示未標記白蛋白與樣本中標記白蛋白競爭結(jié)合芯片上固定的捕獲抗體，呈濃度依賴性。陣列內(nèi)變異系數(shù)為3．35％-7．59％，陣列間變異系數(shù)為6．47％-9．84％；抗體芯片檢測值與免疫比濁法檢測值顯著相關(guān)（R2=0．9206），且