蛋白微陣列技術檢測抗可提取核抗原抗體診斷試驗的初步評價.pdf

1、背景 結締組織病(connective tissue disease，CTD)的特征之一是患者體內(nèi)存在多種針對自身抗原成分的自身抗體，這些抗體與自身免疫損傷發(fā)生的機理以及疾病的臨床表現(xiàn)有著不同程度的相關，并且有部分抗體在發(fā)病前幾年即可在血清中檢測到。目前應用在臨床檢驗中的自身抗體檢測項目達幾十種以上，但每種自身抗體檢測方法并不統(tǒng)一，同一種自身抗體也往往有兩種以上的檢測方法?，F(xiàn)臨床用于檢測自身抗體的常用方法有免疫印跡法(IBT)、

2、免疫雙擴散法(ID)、對流免疫電泳(CIE)及部分抗原的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等檢測手段。不同檢測方法的敏感性和特異性之間的差異不僅給臨床醫(yī)生帶來困惑，為不同醫(yī)療機構中相互參考檢驗結果帶來障礙，此外，由于這些方法需要大量血清在不同反應池進行滴度測定，反復采樣也給患者帶來身體和經(jīng)濟上的損失。所以，開發(fā)和研究新的抗體檢測途徑不僅對推動風濕性疾病基礎研究具有重要意義，而且又是臨床和科研的迫切需要。蛋白微陣列不同于上述這些傳統(tǒng)方法，它可以

3、實現(xiàn)使用微量標本同時篩查不同指標。從而不僅節(jié)省了標本用量，還可以提高系統(tǒng)性免疫病診斷效率。本文用蛋白微陣列法分別對標準血清、連續(xù)常規(guī)送檢的血清標本、正常人及診斷明確患者血清進行了抗可提取核抗原(extr。actable nuclear。antigen，ENA)抗體檢測，并與ID、ELISA方法比較，來評價蛋白芯片方法的敏感度、特異度和診斷準確性。 目的： 1．初步評價蛋白微陣列方法檢測抗ENA抗體的準確性。 2．

4、比較蛋白微陣列方法與ID(金標準)檢測抗ENA抗體結果，計算蛋白微陣列方法的敏感度、特異度、符合率。 3．評價蛋白微陣列方法檢測抗ENA抗體同其他常用方法(ID法、ELISA法)的一致性。 4．比較三種方法檢測抗ENA抗體在不同結締組織病中的陽性率。 材料與方法： 實驗對象：1、衛(wèi)生部臨檢中心的抗ENA抗體標準血清10份；2、風濕免疫科實驗室常規(guī)送檢血清1580份；3、獻血員血清300份；4、診斷明確患者

5、血清445份，其中包括多發(fā)性肌炎/皮肌炎22份、系統(tǒng)性硬化48份、系統(tǒng)性紅斑狼瘡135份、原發(fā)干燥綜合征95份、其他結締組織病72份、非結締組織病73份。 實驗方法：1、蛋白微陣列法：用噴點點樣儀將純化抗原在經(jīng)過化學修飾的96孔微量滴定板孔內(nèi)點制抗原微陣列。然后包被、洗板、封閉、加樣孵育、化學發(fā)光、信號提取數(shù)據(jù)處理。用蛋白微陣列法盲法檢測臨檢中心的標準血清，比對結果。2、ID法：經(jīng)對流免疫電泳和免疫印跡法并聯(lián)篩檢，有沉淀線或出現(xiàn)

6、任一條帶者進一步做經(jīng)典梅花孔法定性實驗，所用抗原為人脾浸出液。雙盲比較蛋白微陣列法和ID法檢測1580份血清及300份獻血員血清，對比結果。3、ELISA：所用試劑盒為購于歐盟，測定方法按說明書進行。三種方法檢測診斷明確的445份血清，比較結果。 結果： 1．蛋白微陣列盲法檢測10份抗ENA抗體標準血清結果解盲后與標準結果對比完全準確。 2．獻血員的300份血清用蛋白微陣列法和ID法檢測結果全部陰性。 3

7、．雙盲比較蛋白微陣列與ID法檢測1580份連續(xù)送檢血清結果： 1)以ID為金標準，蛋白微陣列靈敏度抗Sm抗體、抗RNP抗體、抗SSA抗體、抗SSB抗體、抗rRNP抗體95％可信區(qū)間均大于90％，抗Scl-70抗體和抗Jo-1抗體靈敏度95％可信區(qū)間均大于85％；特異度除抗SSA抗體外(84.88％～84.94％)、抗SSB抗體(89.91％～89.95％)、抗rRNP抗體(89.17％～89.41％)其余抗體特異度95％可信區(qū)間

8、均大于909a；除抗SSA抗體(86.87％～86.91％)外其余抗體符合率95％可信區(qū)間均大于90％。p<0.05。 2)抗RNP抗體(κ=0.833)、抗SCL-70抗體(κ=0.786)、抗Jo-1抗體(κ=0.920)三種抗體兩種方法有很好的一致性κ>0.75；在檢測抗Sm抗體(κ=0.423)、抗SSA抗體(κ=0.646)、抗SSB抗體(κ=0.443)、抗rRNP抗體(κ=0.17)，兩種方法一致性較好。p<0.0

9、5。 3)以ID為金標準，蛋白微陣列檢測七種抗體的ROc曲線下面積均大于0.9，p<0.05。 4)在抗Sm抗體、抗RNP抗體、抗SSA抗體、抗SSB抗體四種抗體蛋白微陣列陽性率(5.89％、8.40％、29.67％、14.21％)高于ID法(1.65％、6.83％、18.13％、4.95％)，p<0.05。而在檢測抗Scl-70抗體、抗Jo-1抗體、抗rRNP抗體兩種方法的陽性檢出率沒有差別，p>0.05。 4

10、．三種方法比較結果： 1)抗Scl-70抗體、抗Jo-1抗體、抗rRNP抗體：蛋白微陣列法與ID法檢測此三種抗體一致性極好(κ=0.830、0.891、0.769)，p<0.05；蛋白微陣列法檢測SSC、PM/DM、SLE三組血清三種抗體各自陽性率分別為54.2％、27.3％、16.7％與ID法62.5％、31.8％、11.1％比較無差別，p=0.125、1.000、1.000。蛋白微陣列法與ELISA結果完全一致。 2

11、)抗Sm抗體：SLE組，免疫微陣列與ID一致性較好κ=0.631，而與ELISA比較一致性極好1(=O．884，p<0．05；抗RNP抗體：在SLE、pSS、CTD各組中三種方法一致性均很好(K>O．7，p<0．05)；抗SSA抗體：蛋白微陣列法與ELISA法一致性極好，各組κ>0.85，p<0.05，蛋白微陣列與ID一致性較好κ在0.4～0.75之間，p<0.05；抗SSB抗體：蛋白微陣列法與ELISA法一致性較好，κ在0.682～0

12、.820之間，p<0.05，蛋白微陣列與ID一致性較差，κ在0.250～0.318之間。 3)抗Sm抗體、抗SSA抗體、抗SSB抗體在各組中陽性檢出率在蛋白微陣列與ELISA之間無差異(p>0.05)，但兩種方法陽性率均大于ID法p<0.05?？筊NP抗體的陽性率比較在各組中蛋白微陣列與ELISA之問無差異，除SLE組蛋白微陣列陽性率大于ID外(p<0.05)，其余各組陽性率與ID法也無差異。 結論： 1．蛋白微

13、陣列方法檢測抗ENA抗體靈敏度和特異度均較高，且與ID和ELISA法有較高的符合率，檢測結果準確。 2．檢測抗Sm抗體、抗RNP抗體、抗SSA抗體、抗SSB抗體敏感度高于ID法，但與ELISA比較無差異。檢測抗Scl-70抗體、抗Jo-1抗體、抗rRNP抗體的敏感度與ID、ELISA均無差別。 3．蛋白微陣列方法具有高通量、并行、快速、敏感、特異等優(yōu)點適于臨床篩檢應用。但不同技術平臺報告結果不盡一致，需要進一步優(yōu)化穩(wěn)定技