三種真菌毒素蛋白質(zhì)微陣列檢測方法的初步研究以及抗四環(huán)素多克隆抗體的制備.pdf

1、1.真菌毒素(Mycotoxin)是真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，通常存在于霉變的谷物中，一旦通過食物鏈進(jìn)入人體后，將可能造成致畸、致突變和致癌等嚴(yán)重危害，因此在全球食品安全問題中備受關(guān)注。目前，真菌毒素的檢測一般采用高效液相色譜法(HPLC)或酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，前者檢測靈敏度高，但樣品前處理煩瑣、操作復(fù)雜、時(shí)間長，所需設(shè)備較昂貴；后者操作簡便、快速，但每次只能完成一種真菌毒素的檢測。因此，具有高通量優(yōu)點(diǎn)的蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)將是真菌

2、毒素多殘留快速檢測的發(fā)展趨勢。本研究在前期已制備出玉米赤霉烯酮(Zearelenone，ZEN)、黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)三種真菌毒素人工抗原及其相應(yīng)單克隆抗體的基礎(chǔ)上，采用間接競爭的檢測原理，以熒光作為檢測信號，對ZEN、AFB1和DON蛋白質(zhì)微陣列檢測方法進(jìn)行了初步研究。結(jié)果如下： (1)ZEN、AFB1和DON蛋白質(zhì)微陣列單指標(biāo)檢測的研

3、究。 采用正交實(shí)驗(yàn)分別確定了ZEN、AFB1和DON人工抗原的最佳點(diǎn)陣濃度為40μg/L、40μg/L和20μg/L，對人工抗原固定條件、封閉方式和二抗?jié)舛冗M(jìn)行了單因素優(yōu)化，確定了4℃過夜固定、37℃ 20 min封閉和2μg/L羊抗鼠IgG-CY3二抗為三個單因素實(shí)驗(yàn)的最佳條件，進(jìn)而以ZEN、AFB1和DON標(biāo)品分別進(jìn)行間接競爭抑制實(shí)驗(yàn)，繪制了ZEN、AFB1和DON蛋白質(zhì)微陣列單指標(biāo)檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，靈敏度(IC50)分別為2

4、.1μg/L、0．29μg/L和86.8 ng/L，線性檢測范圍分別為0.5-10 ng/L、0.125-1.0ng/L和50-400ng/mL。 (2)同時(shí)檢測ZEN、AFB1和DON蛋白質(zhì)微陣列的初步研究。 在研究結(jié)果(1)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了同時(shí)檢測ZEN、AFB1和DON蛋白質(zhì)微陣列的初步研究，確定了羊抗鼠IgG-CY3二抗的最佳濃度為4μg/L，以ZEN、AFB1和DON標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行間接競爭抑制實(shí)驗(yàn)，繪制了同時(shí)檢

5、測ZEN、AFB1和DON蛋白質(zhì)微陣列的標(biāo)準(zhǔn)曲線，靈敏度(IC50)分別為1.3ng/L、0．154 ng/mL和70.4ng/mL，線性檢測范圍分別為0.75-6ng/mL、0.125-0.6ng/mL和25-200ng/mL，均滿足我國規(guī)定的最高允許限量的檢測要求。 2. 四環(huán)素(Tetracycline，TC)是由鏈霉菌產(chǎn)生的一種堿性廣譜抗生素，因價(jià)格低廉，抗菌效果較好，在畜禽類養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用，不可避免將造成動物體內(nèi)四環(huán)

6、素的殘留，即使殘留量很小，但長期食用，對人體健康仍具有很大的潛在危害。因此，對四環(huán)素殘留進(jìn)行及時(shí)檢測是預(yù)防和控制其危害的有效手段。本研究進(jìn)行了抗四環(huán)素多克隆抗體的制備研究，旨在建立四環(huán)素的免疫學(xué)檢測方法。結(jié)果如下： 采用甲醛一步連接法(Mannich反應(yīng))分別制備了四環(huán)素偶聯(lián)陽離子化牛血清白蛋白(TC-cBSA)人工抗原和四環(huán)素偶聯(lián)卵清白蛋白(TC-OVA)人工抗原。經(jīng)紫外圖譜鑒定后，以TC-cBSA為免疫原對三只BAILB/C