骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和微囊化施旺氏細(xì)胞移植促進(jìn)心梗區(qū)治療性血管新生和改善心功能的研究.pdf

1、背景：
　　 當(dāng)前，缺血性心臟病及其并發(fā)癥的發(fā)病率和死亡率仍然維持在較高水平。急性心肌梗死后心功能障礙主要是由于心肌細(xì)胞的損失和心肌纖維化造成的左室重構(gòu)所造成。目前的治療策略，包括藥物治療、介入治療和外科手術(shù)，不能從根本上改善其病理生理過(guò)程，減少并發(fā)癥的發(fā)生。幸運(yùn)的是，心肌細(xì)胞成形術(shù)的出現(xiàn)使急性心肌梗死的治療看到了新的希望。心肌細(xì)胞成形術(shù)是一種具有發(fā)展?jié)摿Φ募?xì)胞治療方法，即通過(guò)向梗死區(qū)域植入干細(xì)胞從而替代壞死的心肌細(xì)胞。其中，骨

2、髓間充質(zhì)干細(xì)胞因其具有取材方便、自身移植無(wú)免疫排斥反應(yīng)、無(wú)醫(yī)學(xué)倫理道德爭(zhēng)議等優(yōu)勢(shì)而成為一種理想的治療心肌損傷的移植細(xì)胞。
　　 移植入心肌的干細(xì)胞一方面可以向心肌細(xì)胞分化，另一方面也可以在旁分泌、自分泌等的影響下促進(jìn)心梗區(qū)治療性血管新生，恢復(fù)缺血區(qū)的再灌注，從而促進(jìn)心肌重塑，改善心功能。然而，無(wú)論在動(dòng)物試驗(yàn)還是臨床實(shí)驗(yàn)上，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植只能部分地改善梗塞后心臟的心功能，其原因之一可能為周圍的微環(huán)境中缺乏持續(xù)分泌的促血管生長(zhǎng)

3、各種因子如VEGF、TGF等。
　　 以往研究表明神經(jīng)和血管相伴行，近來(lái)進(jìn)一步的研究探討了其中的分子機(jī)制。在小鼠胚胎肢體皮膚上，小動(dòng)脈而不是靜脈特異性地與外周感覺神經(jīng)伴行，外周感覺神經(jīng)或施旺氏細(xì)胞地缺失可以導(dǎo)致小動(dòng)脈生成障礙，同樣在體外共培養(yǎng)時(shí)，這些細(xì)胞的存在也可以誘導(dǎo)胚胎內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)動(dòng)脈標(biāo)志物，其原因推測(cè)是施旺氏細(xì)胞分泌的VEGF能夠介導(dǎo)胚胎內(nèi)皮細(xì)胞的動(dòng)脈化。同樣在體外實(shí)驗(yàn)證明，高濃度的VEGF能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向動(dòng)脈樣的內(nèi)皮

4、細(xì)胞分化，低濃度的VEGF則可以上調(diào)靜脈內(nèi)皮的標(biāo)志物。因此施旺氏細(xì)胞在血管的動(dòng)脈樣分化和成熟中具有重要作用。施旺氏細(xì)胞能大量持續(xù)分泌生長(zhǎng)因子VEGF、TGF、PDGF等和各種生物活性物質(zhì)以及分泌基質(zhì)，是天然的生長(zhǎng)因子之“庫(kù)”。因此我們推測(cè)在不僅僅是高濃度的VEGF在間充質(zhì)干細(xì)胞的內(nèi)皮分化過(guò)程中起作用，可能還有許多其它因子也參與了其中的調(diào)節(jié)，所以我們?cè)O(shè)計(jì)在心梗區(qū)的治療性血管新生中直接引入施旺氏細(xì)胞。
　　 然而同種異體的施旺氏細(xì)胞

5、具有較強(qiáng)的抗原性，移植后很快被宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別而發(fā)生急性甚至超急性的排斥反應(yīng)，嚴(yán)重制約了其在細(xì)胞移植中的應(yīng)用，而微囊化技術(shù)正是細(xì)胞移植中是實(shí)現(xiàn)免疫隔離的極佳手段。微囊膜具有選擇性通透功能，允許氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和一些具有生物活性的小分子物質(zhì)自由出入，而阻止免疫細(xì)胞和大分子抗體透過(guò)半透膜，從而實(shí)現(xiàn)其免疫隔離功能。
　　 研究目的:
　　 我們?cè)O(shè)計(jì)通過(guò)聯(lián)合移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和微囊化施旺氏細(xì)胞在心梗區(qū)域，通過(guò)施旺氏細(xì)胞持續(xù)分泌

6、的生長(zhǎng)因子和各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)化，提高心梗區(qū)的治療性血管新生，從而改善心功能。
　　 研究方法:
　　 一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)
　　 將從SD大鼠股骨、脛骨得到的骨髓以全骨髓培養(yǎng)法種植到塑料培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃、含5％CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液是含10％胎牛血清的α-MEM，培養(yǎng)液中加入青霉素(100IU/mL)和鏈霉素(100μg/mL)。接種后24-48小時(shí)初次換液，去

7、除其它非貼壁細(xì)胞，不需沖洗，動(dòng)作盡量輕柔，以免將附著于瓶底的半貼壁細(xì)胞洗掉。之后每2-3天更換次培養(yǎng)基，12-14天后傳代。細(xì)胞行流式細(xì)胞檢驗(yàn)。P3代細(xì)胞用于移植，移植前72小時(shí)BrdU標(biāo)記細(xì)胞。
　　 二、施旺氏細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
　　 無(wú)菌條件下取出生1-3天SD大鼠坐骨神經(jīng)，剝?nèi)ネ饽?，剪?.5-1mm小塊。置于37℃培養(yǎng)箱，0.25％胰蛋白酶和0.125％膠原蛋白酶消化15分鐘。離心后種植在多聚賴氨酸鋪瓶的培養(yǎng)

8、瓶?jī)?nèi)于37℃、含5％CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液是含10％胎牛血清的DMEM/F12，培養(yǎng)液中加入青霉素(100IU/mL)和鏈霉素(100lg/mL)。24小時(shí)后加入阿糖胞苷(5μg/ml)處置3天，以去除成纖維細(xì)胞。換液后全培養(yǎng)液加入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(20ng/ml)和福司柯林(4μM)促進(jìn)增殖。7-8天傳代。常規(guī)制備細(xì)胞爬片，固定后行S-100免疫熒光染色，并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。
　　 三、微囊化施旺氏細(xì)胞制備及分泌活

9、性測(cè)定
　　 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的施旺氏細(xì)胞收集后，用1.5％海藻酸鈉溶液重懸，制備成細(xì)胞終濃度為4×106ml-1細(xì)胞懸液。用0.4mm注射器在微囊發(fā)生器產(chǎn)生的4000伏靜電場(chǎng)下滴入100mM氯化鈣溶液內(nèi)形成海藻酸鈣微珠。20分鐘后收集微珠，置于0.05％多聚賴氨酸溶液中成膜。0.15％海藻酸鈉中和后，用55mM枸櫞酸鈉水化內(nèi)核，獲得施旺氏細(xì)胞微囊。施旺氏細(xì)胞微囊置于37℃、含5％CO2的潮濕培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。部分隔日換液，收集上清，

10、用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒測(cè)定分泌的VEGF含量。同法制備空白微囊。
　　 四、大鼠心梗模型的制備及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和微囊化施旺氏細(xì)胞的移植
　　 結(jié)扎前降動(dòng)脈方法制作大鼠心梗模型，確認(rèn)心梗后，使用29G注射器將BrdU標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和/或微囊化施旺氏細(xì)胞注入心梗組織周圍。動(dòng)物模型分為五組:微囊化施旺氏細(xì)胞+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(n=10)，空白微囊+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(n=9)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(n=8)，微囊化施旺氏

11、細(xì)胞(n=9)以及空白對(duì)照組(n=10)。
　　 五、移植后心功能的評(píng)定與心梗面積的測(cè)量
　　 存活大鼠分別在3天、2周、4周麻醉后行超聲心動(dòng)圖檢查。測(cè)量左室收縮膜內(nèi)徑、左室舒張末內(nèi)徑，并計(jì)算左室短軸縮短率。4周后處死大鼠，取出心臟，沿短軸切為1mm心肌組織片。置于2％TTC溶液37℃孵育30分鐘，拍照并分析。
　　 六、移植后間充質(zhì)干細(xì)胞生存率的計(jì)算與梗死區(qū)新生血管密度的測(cè)定
　　 梗死區(qū)域組織固定包埋

12、后，切片。兔抗大鼠BrdU單克隆抗體行免疫熒光檢測(cè)，隨機(jī)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，分組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，測(cè)定充質(zhì)干細(xì)胞生存率。兔抗大鼠vWF單克隆抗體行免疫組化檢測(cè)，隨機(jī)視野計(jì)數(shù)新生血管數(shù)量，分組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，測(cè)定新生血管密度。
　　 七、移植后心肌組織內(nèi)vWF和VEGF表達(dá)量的測(cè)定
　　 應(yīng)用Westernblot技術(shù)，檢測(cè)組織中vWF和VEGF表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 一、施旺氏細(xì)胞鑒定、施旺氏細(xì)胞微囊

13、分泌活性測(cè)定
　　 分離純化的施旺氏細(xì)胞經(jīng)免疫熒光測(cè)定，S-100陽(yáng)性表達(dá)率超過(guò)95％。
　　 微囊內(nèi)施旺氏細(xì)胞能存活，并隨著增殖，其分泌的VEGF逐漸增加，8天后達(dá)到813.43±86.50pg.ml-1/48h，與沒有微囊化的施旺氏細(xì)胞821.65±83.30pg.ml-1/48h無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明徽囊膜不會(huì)影響VEGF的進(jìn)出。
　　 二、心功能與心梗面積
　　 超聲心動(dòng)圖檢查顯示，心梗后左室短軸縮短

14、率減小，左室收縮膜內(nèi)徑、左室舒張末內(nèi)徑逐漸增大。但移植后4周，聯(lián)合移植微囊化施旺氏細(xì)胞+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組左室短軸縮短率減小，左室收縮膜內(nèi)徑與左室舒張末內(nèi)徑逐漸增大的趨勢(shì)較其他組小(P＜0.01)。空白微囊+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組雖然也有改善，但較聯(lián)合移植組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異小。同樣，心梗面積聯(lián)合移植組最小，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P＜0.01）。
　　 三、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生存率
　　 在所有移植有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的組別

15、中，均發(fā)現(xiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。其中微囊化施旺氏細(xì)胞+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組最多，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(13.71±2.14，12.95±1.92vs.20.79±2.89/HPF,P＜0.01)。
　　 四、新生血管密度
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示四組治療組新生血管密度均較對(duì)照組增加。其中以聯(lián)合移植組增加明顯，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。同時(shí)，微囊化施旺氏細(xì)胞較空白微囊+骨髓間充質(zhì)于細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)于細(xì)胞組增加(P＜0.05)。