缺氧預處理骨髓間充質干細胞移植減少大鼠心肌梗死后心肌細胞凋亡并改善心功能.pdf

1、心肌梗死(myocardialinfarction，MI)，是指冠狀動脈閉塞血流中斷，部分心肌因嚴重而持久的缺血而發(fā)生局部壞死，導致了心肌細胞的不可逆的損傷和丟失以及瘢痕的形成，是引起充血性心力衰竭的主要原因。 急性心肌梗死的治療，早期在于盡快挽救瀕死的心肌防止梗塞面積擴大，縮小心肌缺血的范圍。近十年來，隨著對于細胞(stemcells)認識的不斷加深，很多研究認為干細胞具有組織再生的功能，在體內能分化成為其他成熟細胞，如心肌細

2、胞，血管內皮細胞等等，因此，用干細胞治療心肌梗死的研究引起了大家的普遍關注。 骨髓間充質干細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一種多能干細胞，在心肌微環(huán)境中可分化為心肌細胞和血管內皮細胞，同時它們可以釋放促進血管生成和抗凋亡的因子，如血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)，肝細胞生長因子(hepaticgrowthfactor，HGF))和胰島素樣生長

3、因子(insulin-likegrowthfactor，IGF-1)等，從而激活內源性的修復機制，然而MSCs移植后的療效不夠理想，其低存活力大大限制了細胞治療的效果。有研究通過基因修飾可以增強了MSCs的心肌保護作用，但其安全性和有效性仍然是有爭論的。 以前的報道表明，缺氧在胎盤的發(fā)育過程中有著及其重要的作用，早期人類胚胎就發(fā)生在一個非常低的氧濃度的環(huán)境中。MSCs定居的骨髓也是一個含氧量低的環(huán)境，當MSCs的氧濃度減少到5％

4、時增加了其骨形成的能力，用缺氧刺激MSCs增加了其旁分泌作用。因此我們推測經(jīng)缺氧預處理(anoxicpreconditioning，AP)的MSCs，其心臟保護功能會進一步增加。 研究方法： 體內實驗：骨髓MSCs由沖洗雄性的8周SD大鼠的股骨和脛骨骨髓腔并用密度梯度離心法分離獲取。3-5次傳代后貼壁的梭形骨髓MSCs得到擴增和純化。移植前用流式細胞儀對骨髓MSCs進行檢測。AP-MSCs缺氧(氧濃度<0.5％)3小時。

5、移植細胞在體外用細胞核染料DAPI(50μg/ml)標記30分鐘。體重約250g的成年雄性SD大鼠，開胸結扎左冠狀動脈前降支，建立急性心梗模型。建模成功一周后再次開胸，隨機分3組，分別在心梗周邊區(qū)分3-5點注射150μlDMEM(n=16)，5×106MSCs/150μl(n=16)，或5×106AP-MSCs/150μl(n=16)。在移植后1周，行TUNEL染色評估心肌細胞凋亡，并對凋亡相關蛋白信號通路蛋白的westernblot分

6、析來評價DMEM、MSCs和AP-MSCs三組的心肌細胞凋亡情況。在移植后4周，采用心臟超聲評價大鼠的心功能情況；行HE染色，進行心梗面積計算，血管計數(shù)。 體外實驗：采用分次消化法分離獲取出生1-3天SD大鼠的心肌細胞，以差速貼壁法和Brdu抑制法提純心肌細胞。十天后，心肌細胞隨機分為三組進行缺氧再復氧實驗：DMEM組、MSCs共培養(yǎng)組、AP-MSCs共培養(yǎng)組，缺氧24小時復氧3小時，對照組在含20％胎牛血清的DMEM中標準條件

7、下培養(yǎng)27小時，用AnnexinV-FITC法檢測心肌細胞的凋亡。 結果： 1.心肌細胞和骨髓間充質干細胞的形態(tài)和鑒定心肌細胞呈梭形、多角形，具有搏動能力；MSCs分離培養(yǎng)至第三代就較純，顯微鏡下幾乎見不到雜質細胞，進行細胞表面標記鑒定發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細胞表達粘附分子CD44和CD90，而很少細胞表達造血細胞表面標記CD45，這結果符合MSCs的特征。 2.MSCs特別是AP-MSCs減少了缺氧再復氧誘導的心肌細胞凋亡

8、正常培養(yǎng)的心肌細胞凋亡率低(2.16±0.78％)，缺氧再復氧后，心肌細胞凋亡明顯增加(21.5±2.71％，vs正常培養(yǎng)組，P<0.05)，與MSCs共培養(yǎng)后其凋亡率降低(17.47±1.62％，vsDMEM組，P<0.05)，而與AP-MSCs共培養(yǎng)后其凋亡率進一步降低(11.01μ2.10％，vsDMEM組和MSCs組，P<0.05)。 3.MSCs和AP-MSCs對心肌細胞凋亡相關蛋白表達的影響MSCs特別是AP-MSC

9、s提高了bcl-2/bax的比值，減少了缺氧再復氧后的心肌細胞的caspase-3的激活。 4.MSCs的移植后的體內追蹤細胞移植后4周，在SD大鼠心肌內可見DAPI標記的MSCs或AP-MSCs，表明心肌注射成功，并有MSCs在心肌內定植。 5.MSCs特別是AP-MSCs減少了心梗后的心肌細胞凋亡心梗后心肌細胞凋亡明顯增加(DMEM組：14.54±0.60％，vsSham組，P<0.05)，MSCs移植組凋亡減少(1

10、1.18±0.88％，vsDMEM組，P<0.05)，AP-MSCs移植組凋亡進一步減少(9.03±0.42％，vsDMEM組和MSCs組，P<0.05)。Western-blot檢測也發(fā)現(xiàn)MSCs移植特別是AP-MSCs移植提高了bcl-2/bax的比值，減少了心肌caspase-3的激活。 6.MSCs特別是AP-MSCs移植改善了心梗后大鼠的心功能心梗后大鼠心功能明顯下降(FS％20.94±1.20，vsSham47.64

11、±1.55，P<0.05)，MSCs移植后心功能增加(FS％37.12±2.00，vsDMEM，P<0.05)，AP-MSCs移植更為明顯(FS％43.32±1.82，vsMSCs，P<0.05). 7.MSCs特別是AP-MSCs移植減少心梗面積細胞移植后四周MSCs組心梗面積減少(38.76±1.42％，vs.DMEM組：47.30±2.63％，P<0.05)，而AP-MSCs組心梗面積進一步減少(32.8±1.67％，vs

12、MSCs組，P<0.05)。 8.AP-MSCs移植增加了心梗后心肌的血管密度和VEGF的表達AP-MSCs移植組血管密度增加(6.10±0.23，vs.DMEM組.4.88±0.37和MSCs組：4.78±0.27，P<0.05)，并且VEGF表達增加。 結論： MSCs上調了缺氧后復氧的大鼠心肌細胞Bcl-2/Bax比例并抑制caspase-3的激活，從而減輕了心肌細胞的凋亡。缺氧預處理增強了這種作用。