尼克酰胺預(yù)處理通過改善線粒體應(yīng)激減少缺氧后心肌細(xì)胞死亡.pdf

1、嚴(yán)重?zé)齻缙谛募∪毖呀?jīng)聚焦大量的基礎(chǔ)研究和臨床治療。燒傷后心肌缺血常見原因是氧供和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的緩慢耗竭。越來越多的研究表明燒傷后缺血缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死和凋亡是燒傷早期心肌功能喪失的主要原因。同時(shí)，線粒體失能在心肌缺血死亡的病理生理發(fā)生中也發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。缺血缺氧導(dǎo)致活性氧簇產(chǎn)生，破壞線粒體復(fù)合體完整性，胞內(nèi)ATP減少與線粒體膜電位降低；彼此相互作用引起線粒體通透性增強(qiáng)，激活前凋亡蛋白和細(xì)胞色素c釋放。除此之外，由于細(xì)胞能量供應(yīng)不足，嚴(yán)

2、重且長(zhǎng)時(shí)間的缺血易導(dǎo)致細(xì)胞壞死。這些研究均提示維持線粒體功能的重要性，特別在局限燒傷后心肌凋亡和壞死方面。因此，尋找有前景的藥物是治療燒傷后心肌損害的關(guān)鍵。
　　 尼克酰胺即煙酰胺，是一種水溶性維生素(維生素B3)，也是輔酶β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的前體。在藥理學(xué)上，尼克酰胺在保持正常細(xì)胞功能和代謝方面被認(rèn)為發(fā)揮著重要作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Wistar大鼠短暫局部腦缺血后，給予尼克酰胺治療能改善神經(jīng)病變和減小梗死體積。同時(shí)，尼克酰胺也能

3、減少腦創(chuàng)傷后急性腦皮質(zhì)神經(jīng)元死亡和水腫，提示尼克酰胺抗缺血缺氧作用。近來的實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)給小鼠喂養(yǎng)富含尼克酰胺的飲食能促使心肌細(xì)胞過表達(dá)磺酰脲類受體，從而發(fā)揮抗缺血再灌注損傷作用。但是，目前仍然沒有基礎(chǔ)研究檢測(cè)尼克酰胺治療缺氧后心肌細(xì)胞壞死和凋亡的直接效應(yīng)以及其分子機(jī)制。
　　 在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下尼克酰胺通過抑制氧化應(yīng)激和改善能量生成，減少心肌細(xì)胞壞死和凋亡從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。
　　 一、材料與方法

4、>　　 采用體外實(shí)驗(yàn)的方法。
　　 檢測(cè)常氧條件下尼克酰胺抗心肌細(xì)胞死亡效應(yīng)
　　 遵循既有方法，原代乳大鼠心肌細(xì)胞從新生SD大鼠(2-3天)的心室分離和培養(yǎng)。給予心肌細(xì)胞不同劑量尼克酰胺(2.5，5，10，和20 mM)作用16h后，檢測(cè)常氧條件下細(xì)胞死亡劑量依賴效應(yīng)。細(xì)胞死亡以Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RIP和CC3蛋白表達(dá)量進(jìn)行評(píng)估。10mM尼克酰胺預(yù)處理后檢測(cè)LDH釋放量、ATP，NAD+和NADP+含量

5、，以評(píng)估其對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)。
　　 檢測(cè)尼克酰胺抗缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡效應(yīng)
　　 給予心肌細(xì)胞不同劑量尼克酰胺(2.5，5，10，和20 mM)作用16h后，進(jìn)行6h缺氧(94%N2，5% CO2，1% O2)處理，檢測(cè)缺氧條件下其對(duì)細(xì)胞死亡的劑量依賴效應(yīng)。以Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RIP和CC3蛋白表達(dá)量評(píng)估細(xì)胞死亡。10mM尼克酰胺預(yù)處理后，再缺氧處理6h，以LDH釋放量和TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞死亡。

6、>　　 檢測(cè)尼克酰胺抗缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡的保護(hù)機(jī)制
　　 所有實(shí)驗(yàn)采用10mM尼克酰胺預(yù)處理后，再缺氧處理6h，與正常對(duì)照組和缺氧組對(duì)比。采用激光共聚焦檢測(cè)ROS含量、Western blot檢測(cè)抗氧化酶(SOD和catalase)含量，觀察尼克酰胺對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的抗氧化效應(yīng)。ATP，NAD+和NADP+含量進(jìn)一步用以檢測(cè)能量生成；線粒體膜電位用以評(píng)估線粒體自穩(wěn)。
　　 二、主要結(jié)果與結(jié)論
　　 1.在常氧條

7、件下，尼克酰胺減少心肌細(xì)胞死亡呈劑量依賴關(guān)系(細(xì)胞死亡評(píng)估通過檢測(cè)RIP和CC3蛋白表達(dá))，但作用濃度為10mM的尼克酰胺預(yù)處理16h沒有改變常氧細(xì)胞中LDH釋放和ATP含量。另外，尼克酰胺明顯增加細(xì)胞內(nèi)NAD+和NADP+水平。這些數(shù)據(jù)提示尼克酰胺主要通過提供足夠的ATP合成前體減少細(xì)胞死亡。
　　 2.在缺氧條件下，尼克酰胺減少心肌細(xì)胞死亡呈劑量依賴關(guān)系。與單純?nèi)毖踅M相比，10mM尼克酰胺預(yù)處理明顯降低缺氧誘導(dǎo)的LDH釋放和

8、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。這些結(jié)果證明尼克酰胺預(yù)處理減少缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
　　 3.尼克酰胺預(yù)處理顯著減少細(xì)胞內(nèi)ROS含量、增加抗氧化酶SOD和catalase的蛋白表達(dá)，提示尼克酰胺預(yù)處理通過增加心肌細(xì)胞抗氧化能力有效地較少缺氧誘導(dǎo)的線粒體氧化應(yīng)激。
　　 4.尼克酰胺預(yù)處理增加NAD+、ATP含量和線粒體膜電位到接近正常對(duì)照水平，而在缺氧組明顯降低?？傊?，缺氧條件下尼克酰胺預(yù)處理通過促進(jìn)能量合成有效地阻止線粒體膜電位