乙肝扶正排毒膠囊體外抗乙肝病毒及對NF-kb活化干預(yù)的實驗研究.pdf

1、目的： 肝癌HepG2.2.15細胞株廣泛應(yīng)用于HBV生活周期、發(fā)病機理、免疫效應(yīng)細胞及抗病毒藥物評價等研究，是申報肝炎新藥必備的抗病毒實驗?zāi)Ｐ汀?近年的研究表明，中藥有較好的改善乙肝病人的臨床癥狀、保肝降酶退黃及抗乙肝病毒(HBV)的作用，而且副作用少，經(jīng)濟適用，極具開發(fā)價值。研制生產(chǎn)有效、安全、方便的乙型肝炎抗病毒藥物眾人翹首以待。乙肝扶正排毒膠囊組成有虎杖、白花蛇舌草、蚤休、苦味葉下珠、露蜂房、赤芍、丹參、生黃芪、

2、制首烏等。方中黃芪、首烏、白花蛇舌草等具有促進淋巴細胞轉(zhuǎn)化，調(diào)整T細胞亞群比例，增強免疫功能，提高LAK細胞和NK細胞活性，誘導(dǎo)干擾素等作用?；⒄取谆ㄉ呱嗖?、苦味葉下珠等具有抗病毒、抑制HBV-DNA聚合酶的作用，露蜂房、赤芍、丹參活血化瘀，減輕肝細胞損傷，改善肝細胞供氧，促進其恢復(fù)。但是，其機理并不清楚。為了深入探討其治療慢性乙型肝炎的抗病毒作用機制，從實驗醫(yī)學(xué)的角度進一步論證乙肝扶正排毒膠囊抗乙肝病毒的機理，我們以HepG2.2.

3、15細胞株為乙肝抗病毒模型進行藥物的抗病毒實驗和NF-κB活化的實驗研究。 方法： 1.乙肝扶正排毒膠囊含藥血清的制備： 清潔級、健康Wistar大鼠4只，雌雄各半，由南方醫(yī)科大學(xué)動物飼養(yǎng)中心提供。自由飲水，喂飼南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供的鼠顆粒飼料。乙肝扶正排毒膠囊，成人每日臨床劑量0.3g×12粒=3.6g，天晴復(fù)欣膠囊是其三分之一，1.2g/d，余操作均參照此比例。設(shè)計大鼠每次灌胃乙肝扶正排毒膠囊水溶劑1

4、ml/200g，中劑量=臨床成人劑量3.6g×0.018×5=0.162g/kg·次，大鼠灌胃參照王寧生文獻報道，擬用推薦中劑量10倍量制備含藥血清以保證對培養(yǎng)細胞系有較佳抑制效果，配成的實驗用藥濃度0.162g/ml，早晚各1次，用量分別相當于臨床成人劑量10倍，連續(xù)7天，從預(yù)養(yǎng)的4只大鼠中任選一只大鼠等體積生理鹽水灌胃做為空白對照。于最后一次灌胃后2h(灌胃前禁食不禁水12h)腹主動脈取血，無菌分離血清，血清經(jīng)56℃30min滅活，

5、置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2.HepG2.2.15細胞培養(yǎng)： 將HepG2.2.15細胞置于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，DMEM中加入380mg/LG418，150mL/L胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，10mL/L青、鏈霉素，用50g/LNaHCO3調(diào)PH7.2～7.4培養(yǎng)，于5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)液一次。 3.細胞毒性實驗： 乙肝扶正排毒膠囊以培養(yǎng)基等倍稀釋從25mg/m

6、l、12.5mg/ml、6.25mg/ml、3.125mg/ml、1.56mg/ml、0.781mg/ml(陽性對照藥物天晴復(fù)欣膠囊濃度為其三分之一)，加入96孔培養(yǎng)板中，每濃度平行4孔，4天后更換同濃度藥物，同時設(shè)僅加培養(yǎng)基無藥對照組。中藥含色素，不宜采用MTT方法。實驗8天后在鏡下觀察。細胞形態(tài)學(xué)評價方法采用顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化(CPE法)，細胞形態(tài)與增殖生長改變(病變指數(shù))和藥物效應(yīng)關(guān)系分為五個等級。0度：細胞形態(tài)正常無任何反應(yīng)

7、，增殖生長能力無改變。1度：細胞增殖速度減緩，分裂數(shù)下降。鏡下見細胞輪廓增強，反差增大，但細胞仍增殖生長。2度：細胞增殖非常緩慢，細胞分裂指數(shù)顯著下降或接近消失。細胞輪廓非常明顯，胞質(zhì)粗糙，內(nèi)有顆粒堆積。3度：細胞增殖完全停止，分裂相消失，細胞體回縮，細胞間隙增大，細胞輪廓非常明顯，胞質(zhì)極度粗糙，內(nèi)充滿少量堆積物。4度：大量細胞脫離死亡，殘余細胞亦瀕臨死亡或崩裂溶解。結(jié)果用Reed-Meuench法計算藥物對細胞生長的半數(shù)毒性濃度(TC

8、50)和最大無毒濃度(TC0)。 4.藥物對HBV的抑制實驗： 抗HBV效果以治療指數(shù)(TI)評價，TI=半數(shù)毒性濃度(TC50)/半數(shù)抑制劑量(D50)。以藥物作用8天的TI為標準，TI＞2為有效，TI=1為有毒有效，TI＜1為毒性作用。 根據(jù)以上最大無毒濃度(TC0)分別取乙肝扶正排毒膠囊和天晴復(fù)欣膠囊，乙肝扶正排毒膠囊組用培養(yǎng)基配制成高濃度A1組(0.8×TC0)、中濃度A2組(0.4×TC0)、低濃度A3

9、組(0.2×TC0)三個梯度濃度，同樣方法天晴復(fù)欣膠囊組用培養(yǎng)基配制成高中低濃度三個梯度濃度組B1組、B2組、B3組，含藥血清為C組，空白血清為D組，未加藥細部培養(yǎng)組為E組，分別加入24孔板中，每孔1mL，每濃度平行8孔，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第4天吸取培養(yǎng)液，更換相同濃度的藥液繼續(xù)培養(yǎng)，第8天收集培養(yǎng)液上清。將兩次收集的培養(yǎng)液同時測定HBsAg、HBeAg的吸光度值(HBV-DNA取其拷貝數(shù)值，下同)。同時以不含藥培養(yǎng)液培

10、養(yǎng)的HepG2.2.15細胞上清液HBsAg和HBeAg的效價為對照，記錄無藥物細胞對照及給藥組各濃度每孔吸光值，以無藥物細胞對照組的平均吸光度值為100，無細胞對照孔吸光值為空白對照，計算藥物各濃度的抑制百分率(％)。各培養(yǎng)細胞組取上清液后立即置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。ELISA法檢測HBeAg及HBsAg，定量熒光PCR檢測HBV-DNA。操作嚴格按照試劑盒說明書進行。 5.核因子NF-κB活化干預(yù)實驗： SP法免疫組

11、織化學(xué)染色檢測NF-κB因子P65，操作流程按說明書進行。胞核胞漿染成棕黃色為陽性。計數(shù)者采取雙盲法對每張細胞爬片弓字線路計數(shù)1000個細胞中陽性細胞數(shù)目，陽性細胞數(shù)與細胞總數(shù)的比值即陽性細胞率。計數(shù)十張涂片取得10個陽性細胞率數(shù)據(jù)，進行統(tǒng)計分析，用以表示NF-κB的胞核表達強度。 結(jié)果： 1.細胞毒性實驗結(jié)果：顯微鏡檢(CPE)結(jié)果用Reed-Meuench法計算TC50乙肝扶正排毒膠囊為6.61mg/ml，天晴復(fù)欣膠

12、囊為4.11mg/ml。最大無毒劑量乙肝扶正排毒膠囊TC0＜2.81mg/ml，天晴復(fù)欣膠囊TC0＜1.45mg/ml。 2.HBV抑制實驗結(jié)果：乙肝扶正排毒膠囊TC50為6.61mg/ml，對HBsAgID50為1.26mg/ml，治療指數(shù)(TI)為5.25。乙肝扶正排毒膠囊對HBeAg的ID50為1.02mg/ml，治療指數(shù)6.48。乙肝扶正排毒膠囊對HBV-DNA的ID50為0.86mg/ml，治療指數(shù)7.69，遠高于2，

13、提示乙肝扶正排毒膠囊安全有效。相同情況下天晴復(fù)欣膠囊治療指數(shù)為4.46、6.07和6.69。由于加入HepG2細胞模型刺激因素分別為膠囊和血清，抑制劑量上無可比性，故含藥血清C組和空白血清D組與膠囊組A、B組另外分別比較。膠囊組各組數(shù)據(jù)因為有第4天和第8天兩個不同時間點，故用SPSS10.0軟件的析因設(shè)計方差分析，結(jié)果乙肝扶正排毒膠囊和天晴復(fù)欣膠囊不同組間、不同時間點、高低中三個劑量間均有顯著性差異(P＜0.01)，說明乙肝扶正排毒膠囊

14、和天晴復(fù)欣膠囊都存在著劑量越大，病毒抑制效果越好的量效關(guān)系，并且第8天的病毒抑制效果優(yōu)于第4天，以第8天乙肝扶正排毒膠囊高劑量A1組HBV-DNA抑制率81.8±5.7％為最高。含藥血清C組和空白血清D組之間第4天和第8天時間點，用SPSS10.0軟件的獨立樣本t檢驗分析，結(jié)果各指標均有顯著性差異(P＜0.05)，說明含藥血清組抑制對HBV抑制效果優(yōu)于空白血清，第8天時各孔HBV-DNA均轉(zhuǎn)陰。 3.核因子NF-κB陽性細胞百分

15、率結(jié)果：數(shù)據(jù)采用單向方差分析(One-wayANOVA)，結(jié)果各組間具有顯著性差異(F=115.757，P=0.001)，多重均數(shù)之間的兩兩比較用LSD-t檢驗，各組間除未加刺激的空白對照組和空白血清組、乙肝扶正排毒A2組和天晴復(fù)欣B1組、A3組和B2組及B2組和B3組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，其余均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 4.乙肝扶正排毒膠囊A1組、A2組、A3組第8天HBsAg抑制率與核因子NF-κB陽性細胞

16、百分率相關(guān)性統(tǒng)計結(jié)果：乙肝扶正排毒膠囊A1組、A2組、A3組第8天HBsAg與核因子NF-κB陽性細胞百分率的數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件的雙變量相關(guān)分析(Bivariat)進行分析，Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.776，P=0.010(雙側(cè))，結(jié)果乙肝扶正排毒膠囊A1組、A2組、A3組第8天HBsAg與核因子NF-κB陽性細胞百分率之間存在正相關(guān)關(guān)系，說明隨著NF-κB活化率升高，乙肝扶正排毒膠囊組病毒學(xué)指標HBsAg在下降。