大鼠KA致癇后CDNFmRNA表達變化及rhGDNF抗癇、抗凋亡機制的研究.pdf

1、蘇州大學博士學位論文大鼠KA致癇后CDNFmRNA表達變化及rhGDNF抗癇、抗凋亡機制的研究姓名：程慶璋申請學位級別：博士專業(yè)：外科學指導教師：包仕堯2001.6.1大鼠KA斂癇后GDNFmRNA表達變化及rhGDNF抗癇、抗凋亡機制的研究中英文摘要L=15mm，V=430800ram)。模型組(KA致癇組，n=12)于雙側腦室注入KA(03ug／側)，建立大鼠癲癇模型；對照組(n=6)于雙側腦室注入等量生理鹽水。分別于術后4小時、6

2、小時、8小時、12小時、18小時、24小時處死，快速取腦并行冠狀冰凍切片。用體外轉錄法制備35S標記的GDNF反意cRNA探針在切片上行原位雜交。雜交切片部分置于D—maxX—ray膠片暗盒中曝光2周，部分切片在核乳膠NTB一，浸漬后4℃暗盒中曝光4周。膠片和切片分別顯影和定影，切片定影后甲酚紫染色，遞度酒精脫水，二甲苯透明，DPX封片。雜交結果通過顯、定影后宏觀自顯影的D—maxx線膠片圖象和微觀自顯影核乳膠浸漬切片進行分析。前者對照

3、切片標本確定雜交信號部位和雜交信號的強弱，后者通過顯微鏡觀察銀染顆粒的多少確定雜交信號細胞水平、強弱。3結果：對照組鼠未見癲癇發(fā)作，其海馬區(qū)未見GDNFmRNA表達；而模型組于注射KA10一15分鐘出現(xiàn)四級以上癲癇發(fā)作，持續(xù)3小時左右停止，癲癇鼠海馬神經(jīng)元在致癇后4小時以后出現(xiàn)GDNFmRNA表達強烈的上調(diào)反應，12小時達高峰，且各區(qū)均有表達，此后逐漸衰減，24小時恢復正常。二、KA致癇后大鼠海馬邊緣系統(tǒng)神經(jīng)元凋亡分布及海馬Caspas

4、e一3酶活性變化1Ft的：探討KA致癇鼠邊緣系統(tǒng)敏感腦區(qū)細胞凋亡的機制；并檢測KA致癇后鼠海馬Caspase一3酶活性動態(tài)變化2方法：1)雄性SD大鼠，體重220—3009，乙醚麻醉后于立體定位儀定位雙側腦室。分KA致癇模型組和生理鹽水注射對照組(方法同前述)。模型組于癲癇發(fā)作后存活分別為6小時、1天、3天、7天后處死(每時點n=5)，快速取腦冷凍，并行冠狀冰凍切片，取背側海馬、杏仁體、背側丘腦、下丘腦、梨狀皮層為觀察部位。切片用4％多

5、聚甲醛固定后用原位末端標記法(TUNEL)對切片進行凋亡細胞染色標記，DAB顯色，HE復染后封片。對照組于相同時點處死(每時點n=2)，按同樣步驟進行凋亡染色標記。2)雄性SD大鼠按上述同樣方法分為KA致癇模型組與對照組，存活時間為6小時、1天、3天、7天、10天(每時點模型組n=5，對照組n=2)后快速處死取腦，4℃分離出雙側海馬，研磨凍融后制成細胞裂解物用FIENA(Fluorometricimmunosorbentenzymeas

6、say)法檢測Caspase一3酶活性，以熒光AFC相對強度(IJM)表示。3結果1)癲癇后凋亡細胞主要分布在邊緣系統(tǒng)的海馬CAI、CA3、門區(qū)、杏仁體、梨狀皮層、背側丘腦。凋亡細胞在癲癇24小時后即存在，37天為凋亡高峰期。而對照組無凋亡細胞檢出。2)KA致癇后6小時，鼠海馬即有Caspase一3活性顯著增高，一周內(nèi)保持高水平，10天開始下降；而正常鼠海馬幾乎無活性Caspase3檢出。三、外源性rhGDNF的抗癇機制與鈣結合蛋白(O