維康顆粒對疲勞型亞健康大鼠下丘腦蛋白譜的影響.pdf

1、背景： 20世紀80年代中期，前蘇聯布赫曼教授通過研究發(fā)現，除了健康狀態(tài)和疾病狀態(tài)之外，人體還存在著一種非健康非患病的中間狀態(tài)，稱為亞健康狀態(tài)(sub-healthstatus)。世界衛(wèi)生組織的一項全球性調查表明，真正健康的人僅占5％，患有疾病的人占20％，而75％的人處于亞健康狀態(tài)。亞健康狀態(tài)在經濟發(fā)達、社會競爭激烈的國家和地區(qū)中普遍存在，人數一直呈逐年增加的趨勢，成為國際上醫(yī)學界研究的熱點之一。亞健康的臨床表現多種多樣，而通

2、過本課題組的大規(guī)模亞健康流行病學調查研究表明，其中疲勞不僅是亞健康狀態(tài)的重要臨床表現之一，也是導致亞健康發(fā)生發(fā)展的重要原因，疲勞型亞健康是亞健康的主要類型之一。因此，闡明疲勞型亞健康的發(fā)生機制，不僅有助于深入亞健康的病因學研究，而且可以采取積極的措施干預疲勞型亞健康的發(fā)生發(fā)展，會對疲勞型亞健康的防治產生積極的影響，進入良性循環(huán)，向健康方向轉化。在目前有關疲勞型亞健康的研究中，建立較理想的疲勞型亞健康模型是研究得以深入的關鍵。然而目前尚未

3、有比較理想、公認的疲勞型亞健康模型，而動物實驗作為現代生物醫(yī)學研究中的一個極為重要的實驗方法和手段，具有可控性好、結果易獲得、簡便性好、容易復制等優(yōu)點，為研究疲勞型亞健康的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律及防治措施，研制疲勞型亞健康動物模型具有重要的意義。以往研究表明下丘腦在疲勞的形成中起有重要的調節(jié)作用，而蛋白質組學雙向電泳技術為研究疲勞發(fā)生機制新的有效技術手段。因此，通過制備疲勞型亞健康大鼠模型，利用蛋白質組學的實驗技術，著手于整體，全面觀察疲勞型亞

4、健康大鼠以及維康顆粒干預后疲勞型亞健康大鼠的下丘腦蛋白譜變化，為進一步識別疲勞型亞健康的生物標志物，探討疲勞型亞健康發(fā)生發(fā)展機制，以及維康顆粒抗疲勞型亞健康的相關作用機制提供研究基礎。 目的： 建立疲勞型亞健康大鼠模型，運用蛋白質組學雙向電泳技術初步研究疲勞型亞健康的發(fā)生機理，及維康顆?？蛊谛蛠喗】档淖饔脵C制。 方法： 1.運用睡眠剝奪和負重力竭游泳的復合方法進行造模，即將模型組大鼠放入水深1.5cm的

5、盒子中剝奪睡眠，按其體質量5％負重后再于水深50cm的玻璃缸內進行力竭游泳訓練，以沉入水中10s無法浮出水面判定達到力竭狀態(tài)；正?？瞻讓φ战M不給予任何刺激，自然飼養(yǎng)。經兩次實驗確定睡眠剝奪強度和總的造模時間，以建立疲勞型亞健康大鼠模型，以力竭游泳時間和大鼠血液生化指標為衡量標準，對建立的模型進行評估。 實驗一：確定睡眠剝奪強度，將SPF級健康雄性SD大鼠32只，隨機分為20h/d(每天剝奪睡眠時間20h)、16h/d(每天剝奪睡

6、眠時間16h)、12h/d模型組(每天剝奪睡眠時間12h)和空白對照組(不剝奪睡眠)，每組8只，將模型組大鼠負重力竭游泳13d，觀察大鼠力竭游泳時間的變化，試驗結束后.采大鼠血清檢測生化ALT、AST、TP、A1b、TBIL、BUN、Scr、UA、LDH、CK、GLU、TG、Tch及CRP值，對照空白組分析各實驗組生化值的變化，依據上述兩項內容確定大鼠睡眠剝奪強度。 實驗二：確定造模時間，依據實驗一力竭游泳時間和生化值的變化，確

7、定實驗組為1d(造模時間為1d)、4d(造模時間為4d)、5d(造模時間為5d)實驗組和空白對照組，采各組大鼠血清檢測生化ALT、AST、TP、A1b、TBIL、BUN、Scr、UA、LDH、CK、GLU、TG、Tch及CRP值，空白對照組分析各實驗組生化值的變化，以確定造模天數。 2.在造模過程中給予大鼠維康顆粒干預，比較給藥組、未給藥模型組及空白對照組，以力竭游泳時間為衡量疲勞的標準，觀察維康顆粒抗疲勞作用。 3.統(tǒng)

8、計學分析采用SPSS13.0forwindows統(tǒng)計軟件包處理，同組不同時間點間比較、多個處理組與一個空白對照組比較采用單向方差分析(One-WayANOVA)；重復測量資料采用重復測量數據的方差分析，顯著性水準a=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 4.運用蛋白質組學雙向電泳技術，對正常組、模型組及給藥組大鼠下丘腦蛋白點分離，依據蛋白圖譜分析軟件PDQuest分析下丘腦蛋白譜，發(fā)現有差異的蛋白點，找到與疲勞型亞健康發(fā)生

9、及維康顆?？蛊谧饔脵C制相關的蛋白。 結果： 1.實驗一：20h模型組力竭游泳時間隨著實驗天數的增加出現明顯的改變，呈逐漸降低的趨勢，第13d與第0d相比較明顯縮短，差異有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)，同時血清生化AST、LDH、ALB、GLU、Tch出現了明顯的異常，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，0.01)。16h、12h模型組力竭游泳時間隨著造模天數的增加并無下降，且生化指標與正常組相比較差異無統(tǒng)計學意義(P

10、>0.05)。 2.實驗二：與空白對照組比較，5d模型組中AST、ALT、BUN、Scr、HBDH、CK、TG、Tch水平有明顯的改變，差異有明顯的統(tǒng)計學意義(P<0.05，0.01)，1d、4d模型組大鼠生化值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 3.造模4d后兩組大鼠力竭游泳時間相比較，給藥組大鼠力竭游泳時間明顯延長，兩組之間差異有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 4.運用蛋白質組學雙向電泳技術分別對空白對照

11、組、模型組、維康顆粒高劑量給藥組大鼠下丘腦蛋白進行蛋白點的2-D分離，與空白對照組相比較，模型組共有71個點有明顯差異，維康顆粒高劑量給藥組有65個蛋白點有明顯差異，其中模型組中蛋白點表達上升2倍及以上的點有18個，下降2倍及以上的點有15個；給藥組中蛋白點表達上升2倍以上的點有12，下降2倍及以上的點有9個。其中模型組與空白對照組的差異71個點中，有32個差異點經維康顆粒干預后，有明顯恢復，接近于正常。這些蛋白質的存在，可能與疲勞型亞