siRNA抑制ZNF139前后人胃癌原位移植祼鼠血清差異蛋白質(zhì)的篩選與鑒定.pdf

1、目的:以胃癌SGC7901細(xì)胞原位移植裸鼠模型為對象，通過熒光雙向差異凝膠電泳(2D-DIGE)結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)鑒定技術(shù)等蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究抑制ZNF139后對胃癌原位移植裸鼠血清的影響，為ZNF139參與胃癌進(jìn)展并發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株SGC7901，針對ZNF139基因設(shè)計(jì)siRNA，構(gòu)建siRNA-ZNF139表達(dá)質(zhì)粒。通過X-tremeGENEHP轉(zhuǎn)染試劑

2、介導(dǎo)轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC7901，并通過qRT-PCR檢測細(xì)胞中ZNF139mRNA的相對表達(dá)量，計(jì)算其抑制效率。
　　 2.以siRNA-ZNF139質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC7901，G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞和普通的SGC7901細(xì)胞分別注入裸鼠皮下。每4天測量皮下瘤長短徑，待皮下瘤直徑約1.0cm左右時(shí)取出，剪成大小約1mm3瘤塊進(jìn)行鼠間傳代，將第六代皮下瘤應(yīng)用OB生物膠粘貼法進(jìn)行原位移植。
　　 3.

3、用血清白蛋白/免疫球蛋白清除試劑盒去除胃癌原位移植裸鼠血清中高豐度蛋白，利用SDS-PAGE檢測去除高豐度蛋白前后蛋白的完整性及血清蛋白的變化。
　　 4.采用2D-DIGE技術(shù)分離siRNA-ZNF139干擾前后胃癌原位移植裸鼠血清蛋白。應(yīng)用DeCyderDifferentialAnalysisSoftware選取差異明顯的蛋白點(diǎn)并利用Ettanspotpicker挖取膠中的差異蛋白點(diǎn)，膠內(nèi)酶解后利用LC-MS進(jìn)行分析。再應(yīng)用

4、BioWorks軟件中的SEQUEST運(yùn)算方法進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索。
　　 5.將已鑒定的部分差異蛋白通過蛋白質(zhì)印記(Westernblot)從蛋白質(zhì)水平進(jìn)行驗(yàn)證，檢測是否與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同濃度siRNA-ZNF139質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901細(xì)胞后ZNF139mRNA表達(dá)的變化
　　 qRT-PCR檢測顯示在0μg/ml、0.4μg/ml、0.6μg/ml、0.8μg/ml、

5、1.0μg/ml重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的胃癌SGC7901細(xì)胞中ZNF139mRNA相對表達(dá)量分別為1.003±0.0970,0.7517±0.0436,0.3611±0.0445,0.1622±0.0181,0.5531±0.0377，統(tǒng)計(jì)分析顯示與0μg/ml組相比各組有顯著差異（P＜0.05），其中以0.8μg/ml組抑制效率最高，為83.83％。
　　 2.siRNA抑制ZNF139對裸鼠皮下瘤生長的影響
　　 接種胃癌細(xì)

6、胞SGC7901六天后空白組和陰性組裸鼠均長出皮下瘤，十天后實(shí)驗(yàn)組裸鼠可見皮下瘤，之后瘤體不斷增大。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明空白組皮下瘤體積比陰性組略大，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），siRNA-ZNF139組皮下瘤體積明顯小于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 3.胃癌原位移植裸鼠模型的形態(tài)觀察
　　 陰性組1只裸鼠因麻醉過量死亡，空白組和siRNA-ZNF139組各1只裸鼠于術(shù)后2天死亡，接種2周后15

7、只存活裸鼠上腹部均可觸及明顯腫塊，之后腫塊不斷增大?？瞻捉M原位瘤體積比陰性組略大，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，siRNA-ZNF139組裸鼠瘤體體積明顯小于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。原位移植瘤經(jīng)HE染色組織病理學(xué)檢查均可見核大深染的腫瘤細(xì)胞，證實(shí)為胃癌，原位成瘤率100％。
　　 4.血清蛋白完整性檢測及純化
　　 SDS-PAGE分離血清蛋白后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色顯示各組血清蛋白無明顯降解，用血清白

8、蛋白/免疫球蛋白清除試劑盒處理后的裸鼠血清中高豐度蛋白含量明顯降低，低豐度蛋白條帶更明顯。
　　 5.siRNA抑制ZNF139前后胃癌原位移植裸鼠血清差異蛋白的篩選與鑒定
　　 在2D-DIGE圖譜上分離到的蛋白質(zhì)點(diǎn)平均為4487±46個(gè)，匹配率為83.1％，說明雙向電泳技術(shù)分離血清蛋白質(zhì)組可得到較高的重復(fù)性。應(yīng)用DeCyderDifferentialAnalysisSoftware選取7個(gè)差異明顯的蛋白點(diǎn)。結(jié)合LC-

9、MS鑒定出5種蛋白質(zhì)（APOE、KNG1、α2-MG、mTERF、DIXDCl），其中APOE、KNG1在siRNA-ZNF139組的胃癌血清中表達(dá)下調(diào)，α2-MG、mTERF、DIXDC1表達(dá)上調(diào)。
　　 6.siRNA抑制ZNF139對胃癌原位移植裸鼠血清中APOE、KNG1、mTERF、ZNF139蛋白表達(dá)的影響
　　 應(yīng)用Westernblot法對各實(shí)驗(yàn)裸鼠血清中APOE、KNG1、mTERF和ZNF139的表達(dá)

10、進(jìn)行了驗(yàn)證。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明空白組與陰性組的APOE、KNG1、mTERF和ZNF139的表達(dá)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，與兩對照組相比，siRNA-ZNF139組的APOE、KNG1和ZNF139的表達(dá)量顯著降低，而mTERF的表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。
　　 結(jié)論:
　　 1.siRNA-ZNF139質(zhì)?？筛咝б种芞NF139基因的表達(dá)。
　　 2.siR

11、NA-ZNF139質(zhì)?？梢种莆赴┞闶笃は铝黾霸灰浦擦龅纳L。
　　 3.改良后的組織塊OB生物膠粘貼法建立的人胃癌裸鼠原位移植模型可近似模擬胃癌在人體內(nèi)的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，而且操作簡單、成瘤率高，便于觀察、測量和干預(yù)，可作為目前較理想的研究胃癌的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 4.去除血清中白蛋白和免疫球蛋白等高豐度蛋白為血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 5.DIGE技術(shù)具有較高的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和靈敏度，結(jié)合