胃癌血清蛋白標(biāo)記物的篩選與鑒定.pdf

1、背景：
　　胃癌一直以來都是嚴(yán)重威脅全世界人類健康的惡性腫瘤之一，也是我國最常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率常年居高不下。胃癌的預(yù)后較差，尤其以腫瘤發(fā)展至進(jìn)展期為甚，且及早的診斷和治療可明顯的改善胃癌患者的預(yù)后，降低其死亡率。但多數(shù)胃癌早期患者沒有明顯的自覺癥狀，或僅僅表現(xiàn)為惡心、嘔吐等無特異性的胃腸道癥狀，容易與胃炎、胃潰瘍等相混淆，無法引起人們的重視，從而延誤了病情，錯失最佳的治療時機(jī)。往往就診時多數(shù)患者已經(jīng)處于局部晚期

2、或發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，所以早期的診斷與治療是改善胃癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。目前，臨床上診斷胃癌常用的影像學(xué)檢查主要包括胃鏡及上消化道造影等，但由于醫(yī)生的診斷水平不盡相同，胃癌早期患者的檢出率并不高，而且胃鏡檢查是一種有創(chuàng)的檢查，會引起患者不適，其費(fèi)用較高，因而在胃癌高危人群中不易普及。同時CEA、CA19-9、CA72-4等作為臨床上常用的血清腫瘤標(biāo)記物，因缺乏敏感性及特異性對于胃癌患者的早期診斷幫助并不大。在這樣的背景下，臨床上迫切需要找到新的

3、與胃癌相關(guān)的具有高度敏感性和高度特異性的分子標(biāo)記物，這也成為了胃癌相關(guān)研究的熱點(diǎn)。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)自提出后就得到了飛速的發(fā)展，其含義包括蛋白質(zhì)和基因組兩方面內(nèi)容，可以理解為一種基因組轉(zhuǎn)錄表達(dá)的全套蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究象征著生物學(xué)進(jìn)入了后基因時代，其本質(zhì)是以蛋白質(zhì)組為研究對象，從整體的角度去分析細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成及其活動的規(guī)律，在建立正常蛋白質(zhì)表達(dá)指紋圖譜的基礎(chǔ)上，通過對正常人和患者（血清或瘤體）的蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較分析，

4、從而找到與某種疾病有關(guān)的特異性蛋白質(zhì)。這些具有特異性的蛋白質(zhì)不僅可以作為某種疾病早期診斷的蛋白標(biāo)記物，而且也可為藥物的研發(fā)提供新的分子靶點(diǎn)。進(jìn)而對這些蛋白標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，為疾病的發(fā)生發(fā)展提供病理生理學(xué)機(jī)制。蛋白質(zhì)組學(xué)被認(rèn)為是篩選特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物和藥物分子靶點(diǎn)最有效的方法之一，隨著相關(guān)技術(shù)不斷的更新?lián)Q代，為我們篩選和鑒定胃癌患者血清特異性標(biāo)記物提供了技術(shù)平臺，開辟了胃癌研究的新領(lǐng)域。
　　本次實(shí)驗(yàn)主要依托表面增強(qiáng)激光解

5、吸電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)對胃癌患者血清（術(shù)前組、術(shù)后組、轉(zhuǎn)移組）與正常對照組血清之間進(jìn)行對比檢測，篩選出胃癌患者血清中存在的特異性蛋白質(zhì)或含量與正常人血清有差異的蛋白質(zhì)。使用凝膠電泳（TRICINE-SDS-PAGE）技術(shù)對這些差異性蛋白質(zhì)進(jìn)行分離與純化。通過基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF）技術(shù)對分離純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，最終確定胃癌患者血清中具有特異性的蛋白標(biāo)記物。后期研究其

6、結(jié)構(gòu)與功能，探索特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為胃癌的早期診斷及下一步的臨床治療提供了可能和依據(jù)。
　　目的：
　　通過蛋白組學(xué)技術(shù)篩選并鑒定胃癌患者血清中可能存在的特異性蛋白標(biāo)記物，為胃癌的早期診斷提供更為完善的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型，為進(jìn)一步研究胃癌的血清特異性蛋白標(biāo)記物打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　材料與方法：
　　材料：本研究材料收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科自2013年5月至2014年1月前來就診的

7、60例首診胃癌患者，其中男性患者46例，女性患者14例，年齡42~84歲，平均年齡58±0.5歲。其中20例就診時已證實(shí)胃癌多發(fā)轉(zhuǎn)移，未經(jīng)手術(shù)治療，采集血清標(biāo)本設(shè)為轉(zhuǎn)移組。余40例患者原發(fā)胃癌診斷明確，且無手術(shù)禁忌擬行手術(shù)治療，于術(shù)前1天和術(shù)后第12天各采集血清標(biāo)本一次，分別設(shè)為術(shù)前組和術(shù)后組。所有患者采集標(biāo)本前均未接受化療、放療等治療，經(jīng)手術(shù)和病理診斷為胃腺癌，其組織病理分型均為中、低分化型腺癌。病理學(xué)診斷均經(jīng)過兩位以上的病理學(xué)專家的

8、證實(shí)。所有60例患者的血樣標(biāo)本均自清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取，血液抽取后將血樣放置于干燥試管中于室溫下靜置1小時使血液自然凝固，而后在離心機(jī)中以3000 r/min的速度進(jìn)行離心15min，抽取離心沉淀后的上清液移至 PE管中，置入-80℃冰箱進(jìn)行保存。本實(shí)驗(yàn)通過了本院倫理委員會的倫理審查，受試者均已簽署知情同意書。
　　方法：冰浴中解凍血清，4℃10000r/min離心2min。取96孔板置于冰盒上，每孔加入U(xiǎn)9(9mol/L尿素)，1

9、％ Bar，2%CHAPS10μL，血清和瘤體組織總蛋白樣本5μL，4℃層析柜中600r/min振蕩30min。在震蕩結(jié)束前15 min做蛋白質(zhì)芯片預(yù)處理，芯片裝入加樣器 Bioprocessor中，標(biāo)記下芯片號碼，每孔加入NaAC(100mmol/L，pH4)200μL，層析柜中600r/min振蕩2min，重復(fù)以上操作1次。經(jīng)過U9處理后的96孔板置于冰盒上，用排槍加入NaAC185μL，層析柜中4℃600r/min震蕩2min。取

10、已處理的樣本100μL加到蛋白質(zhì)芯片上，置于層析柜中4℃600r/min結(jié)合60min，甩去殘液，快速拍干。然后加入NaAC200μL，600r/min振蕩5min后，甩去殘液，快速拍干，重復(fù)3次。用200μL去離子水沖洗各孔2次，甩干。芯片風(fēng)干后，每孔分兩次加入50%飽和的SPA1μL，干燥后上機(jī)待檢測。用已知分子量的蛋白質(zhì)芯片對SELDI-TOF-MS系統(tǒng)進(jìn)行校正，使蛋白質(zhì)分子量誤差小于0.1%，然后將結(jié)合好蛋白質(zhì)的WCX2蛋白質(zhì)芯

11、片用質(zhì)譜分析儀進(jìn)行分析。質(zhì)譜分析的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾噪音和聚類分析處理后，對初步篩選出的質(zhì)荷比峰值數(shù)據(jù)做Wilconxon秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)取小于0.01。通過P值來判斷同一m/z峰在各組之間表達(dá)的差異程度，P值越小提示這一m/z峰在兩組之間越有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.胃癌術(shù)前組與正常組的比較結(jié)果
　　胃癌術(shù)前組與正常組的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過減掉基線、去噪及標(biāo)準(zhǔn)化處理，聚類分析得到各自的峰值，兩組峰值經(jīng)過Wilcoxon

12、秩和檢驗(yàn)，從而得到15個特異性m／z峰值(P<0．01)。其中在胃癌術(shù)前組低表達(dá)的為8個，高表達(dá)的7個。通過SVM篩選出youden指數(shù)最高的組合模型，得到m/z峰位于6449.1的蛋白標(biāo)記物。在胃癌術(shù)前組呈高表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度為2299.3±2029.3。在正?；颊呓M明顯低表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度為509.5±168.3。兩組比較差值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。
　　2.胃癌術(shù)后組與術(shù)前組的比較結(jié)果
　　胃癌術(shù)后組與術(shù)前組的質(zhì)譜數(shù)據(jù)

13、經(jīng)過處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，得到 P<0．01的特異性m/z峰6個，其中術(shù)后組中高表達(dá)為4個，低表達(dá)為2個。參考youden指數(shù)最高的組合模型，得到m/z峰位于6449.2的蛋白質(zhì)標(biāo)記物。在胃癌術(shù)前組呈高表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度為1247.9±685.0。在正?；颊呓M明顯低表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度為476.5±157.8。兩組比較差值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。
　　3.胃癌術(shù)前組與轉(zhuǎn)移組的比較結(jié)果
　　胃癌術(shù)前組與轉(zhuǎn)移組的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過處理和統(tǒng)

14、計(jì)學(xué)分析后，得到 P<0．01的特異性m/z峰12個，其中轉(zhuǎn)移組組中高表達(dá)為1個，低表達(dá)11個。參考youden指數(shù)最高的組合模型，得到蛋白質(zhì)標(biāo)記物 m/z峰位于6448.9。在胃癌轉(zhuǎn)移組的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于術(shù)前組，在胃癌轉(zhuǎn)移組表達(dá)強(qiáng)度為1506.9±1036.5。在胃癌術(shù)前組表達(dá)強(qiáng)度為649.7±621.0。兩組比較差值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。
　　4.特異性蛋白的鑒定
　　通過 MALDI-TOF/TOF平臺對樣本

15、分離純化及酶解后所得到的肽段混合物進(jìn)行檢測。m/z峰位于6449的蛋白質(zhì)經(jīng)過鑒定為Apo CⅢ（載脂蛋白CⅢ）。
　　結(jié)論：
　　1. m/z峰位于6449的蛋白質(zhì)經(jīng)過鑒定為Apo CⅢ，考慮為胃癌的血清特異性蛋白標(biāo)記物，為胃癌的早期診斷提供更為完善的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型，對進(jìn)一步研究胃癌的血清特異性蛋白標(biāo)記物具有指導(dǎo)意義。
　　2. m/z峰位于6449的蛋白質(zhì)在胃癌中的表達(dá)程度與其腫瘤進(jìn)展程度呈正相關(guān)，為后期研究