先天性巨結(jié)腸癥血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物的檢測(cè).pdf

1、先天性巨結(jié)腸癥(Hirschsprung disease，HSCR)是一種先天性腸道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺乏癥，又稱無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥(Aganglionosis)，1886年丹麥醫(yī)生HaraldHirschsprung首先提出其特發(fā)性的先天病理改變，1945年Swenson對(duì)HSCR作出了根本性論斷，即病變腸管肌間神經(jīng)叢中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如，腸管不能舒張如"痙攣"腸管，其近段腸管繼而增大。HSCR是小兒外科常見(jiàn)的消化道畸形，在先天性消化道畸形中發(fā)病率居

2、第二位，發(fā)病率約為1/5000～1.76/10000，男女比例約為4：1，男性多見(jiàn)。 HSCR 的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，普遍認(rèn)為是多種因素共同作用的結(jié)果，如缺血、缺氧、病毒、毒素、遺傳等。各種因素作用于神經(jīng)發(fā)育不同階段，抑制了神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育。可概括以下三種情況：1、神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移障礙。胚胎期神經(jīng)嵴細(xì)胞分化及向腸壁內(nèi)移行停頓所致。認(rèn)為是一種多基因遺傳疾病，相關(guān)基因突變或/和表達(dá)異常使神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育、遷移受阻而發(fā)生HSCR，

3、目前研究認(rèn)為RET基因起關(guān)鍵作用。其他研究較多的還有GDNF，EDNR，NCX等。2、微環(huán)境因素阻止神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的正常發(fā)育。如胞外基質(zhì)蛋白、神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其受體的改變，影響了神經(jīng)嵴細(xì)胞的存活和發(fā)育。3、某些局部因素。如缺血、缺氧、免疫因素、巨細(xì)胞病毒和寄生蟲(chóng)感染等毀壞了腸壁內(nèi)神經(jīng)嵴細(xì)胞。 HSCR 術(shù)前診斷主要依據(jù)臨床癥狀結(jié)合對(duì)比灌腸造影(CE)、直腸肛管測(cè)壓(ARM)、直腸黏膜吸引活檢(RSB)、腸肌電圖等輔助檢查。CE診斷準(zhǔn)確

4、率約45.245～80％。新生兒期鋇劑灌腸結(jié)腸造影時(shí)，痙攣段、移行段及擴(kuò)張段分界不清，X線表現(xiàn)不典型。鋇劑灌腸時(shí)由于清潔腸道、肛管內(nèi)注入氣泡等而出現(xiàn)“假性巨結(jié)腸”表現(xiàn)；鋇劑過(guò)稀出現(xiàn)水中毒，嚴(yán)重時(shí)危及患兒生命；若檢查前合并小腸結(jié)腸炎患兒易致腸穿孔造成鋇劑性腹膜炎。ARM對(duì)HSCR診斷準(zhǔn)確率約為64.3％～71.43％。直腸黏膜吸引活檢(RSB)吸引的壓力不易掌握，壓力過(guò)低吸取不到黏膜或者黏膜厚度不夠，壓力過(guò)高有直腸穿孔的危險(xiǎn)。腸肌電圖檢查

5、雖操作簡(jiǎn)單，無(wú)痛苦，可反復(fù)檢查，但肌電圖的生理差異較大，各種波形判斷存在一定技術(shù)誤差，且受腸內(nèi)糞便、小兒哭鬧和外括約肌肌電波形的影響，因而準(zhǔn)確率較低。目前，先天性巨結(jié)腸癥的研究主要集中在病因?qū)W尤其是基因遺傳學(xué)方面，對(duì)于先天性巨結(jié)腸癥的診斷方法的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有新報(bào)道。而目前的診斷方法尚無(wú)法滿足臨床無(wú)創(chuàng)，簡(jiǎn)便，高效，快速的早期診斷要求，因此，探討一種特異性強(qiáng)、靈敏性高、無(wú)創(chuàng)的診斷方法成為必需。 SELDI-TOF-MS技術(shù)是20

6、02年開(kāi)發(fā)的新型蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，應(yīng)用基因芯片的設(shè)計(jì)原理，把層析、質(zhì)譜等技術(shù)合理地與蛋白質(zhì)芯片結(jié)合，可檢測(cè)出傳統(tǒng)方法很難鑒定的蛋白質(zhì)和多肽，具有快速、靈敏、高通量等特點(diǎn)，在卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、甲狀腺癌等的標(biāo)記物篩選和早期診斷研究方面已經(jīng)取得重大突破。 研究目的 檢測(cè)先天性巨結(jié)腸癥患兒血清蛋白質(zhì)，篩選特異的蛋白質(zhì)標(biāo)記物，構(gòu)建用于先天性巨結(jié)腸癥早期篩選及診斷的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型。 材料與方法

7、 1．材料 1.1 標(biāo)本 78例血清標(biāo)本：先天性巨結(jié)腸癥42例，其他類型腸梗阻16例(闌尾炎術(shù)后腸梗阻8例、美克爾憩室術(shù)后腸梗阻3例、炎癥性腸梗阻5例)，正常對(duì)照組20例。所有先天性巨結(jié)腸癥標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)結(jié)果證實(shí)。先天性巨結(jié)腸癥中男33例，女9例，年齡3d-18a。正常對(duì)照組與先天性巨結(jié)腸癥組年齡、性別相匹配。 1.2 設(shè)備表面增強(qiáng)激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Surface Enhanced Laser Desorpt

8、ion/Ionization Time of Flight-Mass Spectrometry，SELDI-TOF-MS)，PBS Ⅱ<'+>Ciphergen Inc．美國(guó))。主要參數(shù)：收集范圍為1000-50000；優(yōu)化范圍為2000-30000． 1.3 芯片弱陽(yáng)離子交換(WCX2)蛋白質(zhì)芯片。 1.4 應(yīng)用軟件和標(biāo)記物評(píng)價(jià)指標(biāo)應(yīng)用軟件：Proteinchip Software 3.1，Biomarker Wiza

9、rd和ZUCI-ProteinChip Data Analyze System軟件包。 支持向量機(jī)(SVM)：MATLAB6.50SU-SVM工具箱。 評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)：靈敏性、特異性、Youden指數(shù)。 2．方法 2.1 血清樣本處理： U9 溶液處理冰浴中解凍的血清標(biāo)本，100Mm NaNC (PH=4) 稀釋后，和Bioprocessor預(yù)處理過(guò)的WCX2蛋白芯片結(jié)合反應(yīng)60分鐘，上述NaNC

10、緩沖液清洗芯片，取出芯片風(fēng)干后點(diǎn)50％飽和的SPA溶液，上機(jī)讀片。 2.2 SELDI操作： SELDI質(zhì)譜儀完成設(shè)置后，記錄每一例樣本的血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖。原始數(shù)據(jù)先用Proteinchip Software 3.1做校正，使總離子的強(qiáng)度及分子量均一化。用Biomarker Wizard和ZUCI-ProteinChip Data Analyze System軟件包過(guò)濾噪音局部極值的方法找出樣本各自的峰，并過(guò)濾信噪比小于

11、2的峰，以10％為最小閾值做聚類分析，得到初步篩選結(jié)果。 2.3 血清樣本分組： ☆組1：先天性巨結(jié)腸癥組與正常對(duì)照組的比較☆組2：其他類型腸梗阻組與正常對(duì)照組的比較2.4 建模方法： 對(duì)初步篩選出來(lái)的質(zhì)荷比峰做Wilconxon秩和檢驗(yàn)，篩選每組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的m/z值。 將有顯著差異的m/z值數(shù)據(jù)輸入支持向量機(jī)進(jìn)一步分析，用訓(xùn)練集建立判別模型，用測(cè)試集檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷男ЯΓY選用于建模的m/z值。 評(píng)

12、價(jià)模型的敏感性、特異性。 結(jié)果 1.先天性巨結(jié)腸癥組與正常對(duì)照組42例先天性巨結(jié)腸癥和20例正常對(duì)照血清標(biāo)本檢測(cè)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)初步過(guò)濾篩選得到213個(gè)M/z峰，對(duì)其相對(duì)強(qiáng)度做wilconxon秩和檢驗(yàn)分析得到P值小于0.01的M/Z峰13個(gè)，從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中，采用SVM篩選出預(yù)測(cè)值的youden指數(shù)最高的組合模型，篩出M/Z位于3221.7、5639.2和6884.2的標(biāo)志物3個(gè)，在先天性巨結(jié)腸癥組低表達(dá)，

13、在正常對(duì)照組高表達(dá)。聯(lián)合三個(gè)潛在標(biāo)記物作為輸入值，留一法交叉檢測(cè)，在測(cè)試集上判別模型的特異性為100％，敏感度為100％。 2.其他類型腸梗阻組于正常對(duì)照組16例其他類型腸梗阻組(闌尾炎術(shù)后腸梗阻8例、美克爾憩室術(shù)后腸梗阻3例、炎癥性腸梗阻5例)和20例正常對(duì)照組血清標(biāo)本檢測(cè)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在M/Z位于3221.7、5639.2和6884.2的3個(gè)血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物處，兩組檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異。 結(jié)論 SE