膽道閉鎖血清早期標(biāo)志蛋白的篩選及鑒定.pdf

1、膽道閉鎖在亞洲國家的發(fā)病率較高，早期診斷及及時手術(shù)治療是影響預(yù)后的關(guān)鍵因素之一；60日齡前手術(shù)，術(shù)后膽汁流的恢復(fù)率、黃疸的消退程度及術(shù)后10年生存率(未肝移植)明顯高于90日齡后手術(shù)的患兒。目前我們臨床針對膽道閉鎖的早期診斷方法，包括觀察大便顏色、肝膽同位素檢查、腹部肝膽B(tài)超、腹部CT/MRI、肝穿刺活檢等，這些檢查各有其優(yōu)缺點，特異度和敏感度均待提高，明確診斷仍依賴剖腹探查，術(shù)中膽道造影。因此，急需研究及發(fā)現(xiàn)早期診斷的無創(chuàng)性生物學(xué)標(biāo)志

2、物。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比較了膽道閉鎖和淤膽型嬰兒肝炎患兒血清蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，目的在于發(fā)現(xiàn)并驗證差異表達(dá)蛋白，為尋找膽道閉鎖早期診斷生物學(xué)標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)。首先利用蛋白質(zhì)組學(xué)的表面加強(qiáng)激光解離-飛行時間-質(zhì)譜(surface enhanced laser desorption/ionization，time offlight，mass spectroscopy，SELDI-TOF-MS)，采用弱陽離子交換蛋白質(zhì)芯片為檢測介質(zhì)，得

3、到蛋白質(zhì)指紋圖譜，在質(zhì)荷比(m/z)1500～30，000Da范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比為8677的蛋白質(zhì)峰在膽道閉鎖患兒組中下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0214)；第二部分，運(yùn)用傳統(tǒng)的雙向電泳結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MassSpectrometry，MALDI-TOF-MS/MS)，該技術(shù)上和SELDI-TO

4、F-MS互補(bǔ)，比較膽道閉鎖和淤膽型嬰兒肝炎患兒血清蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，發(fā)現(xiàn)'SP40，40’、載脂蛋白A-Ⅳ、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、α-1-B糖蛋白等在膽道閉鎖組患兒中高表達(dá)，afamin前體在淤膽型嬰兒肝炎組中高表達(dá)；免疫印跡技術(shù)證實差異蛋白‘Sp40，40’在膽道閉鎖的患兒血清中高表達(dá)，淤膽型嬰兒肝炎血清中低表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)和證實了‘Sp40，40’在兩組患兒血清中表達(dá)的差異，提示‘Sp40，40’可能為膽道閉鎖早期診斷的潛在

5、血清標(biāo)記物。
　　 第一部分、蛋白質(zhì)芯片SELDI-TOF-MS技術(shù)篩選膽道閉鎖早期診斷的血清生物標(biāo)志物
　　 本部分的研究采用蛋白質(zhì)芯片SELDI-TOF-MS技術(shù)比較膽道閉鎖和淤膽型嬰兒肝炎患兒血清蛋白質(zhì)譜的差異，該技術(shù)能檢測到的蛋白峰一般分子量都在2000—30000Da以內(nèi)，可與雙向電泳(主要研究大分子量蛋白)形成技術(shù)上互補(bǔ)，具有快速、操作簡便、樣品用量少和對多樣品的平行檢測等特點，各種樣品可以經(jīng)過簡單的預(yù)處理后

6、直接地加到表面經(jīng)過特殊修飾的芯片上。
　　 入選患兒分兩組，均為出生后30—60日齡的小嬰兒，均有明顯的黃疸，血清結(jié)合膽紅素水平明顯升高；第1組為經(jīng)外科術(shù)中膽道造影明確膽道閉鎖患兒21例，為膽道閉鎖組；第2組經(jīng)同位素肝膽顯像或剖腹探查膽道造影示膽道通暢或經(jīng)過長期隨訪后黃疸消退，證實非膽道閉鎖患兒21例，為淤膽型嬰兒肝炎組，將其設(shè)為對照組。收集這兩組患兒的血清，采用弱陽離子交換蛋白質(zhì)芯片為檢測介質(zhì)，經(jīng)表面加強(qiáng)激光解離-飛行時間-質(zhì)

7、譜(SELDI-TOF-MS)測定，得到蛋白質(zhì)指紋圖譜，并運(yùn)用BioMarker Wizard軟件分析比較；在質(zhì)荷比(m/z)1500～30，000Da范圍內(nèi)，檢測出的25個蛋白峰中，強(qiáng)度變異系數(shù)15％，比較膽道閉鎖與淤膽型嬰兒肝炎患兒之間的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比為8677的蛋白質(zhì)峰在膽道閉鎖患兒組中下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0214)，提示可能是膽道閉鎖早期診斷的蛋白質(zhì)分子標(biāo)志。
　　 第二部分、雙向電泳-質(zhì)譜技

8、術(shù)篩選膽道閉鎖早期診斷的血清生物學(xué)標(biāo)志物
　　 本部分研究在第一部分研究的基礎(chǔ)上，采用傳統(tǒng)的雙向電泳(two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜，進(jìn)一步比較膽道閉鎖和淤膽型嬰兒肝炎患兒血清蛋白質(zhì)譜的差異，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。2-DE技術(shù)作為經(jīng)典的蛋白質(zhì)組技術(shù)，具有可以進(jìn)行蛋白質(zhì)相對定量的比較，以及在同張膠上顯示同型異構(gòu)蛋白等優(yōu)勢，是蛋白質(zhì)組研究常用的方法；蛋

9、白質(zhì)首先根據(jù)等電點的不同，在一向等電聚焦電泳中分離，接著轉(zhuǎn)移到二向SDS-PAGE凝膠上，根據(jù)相對分子量大小的不同被分離。已有許多研究通過2-DE技術(shù)分離血清蛋白質(zhì)組學(xué)，并進(jìn)行疾病相關(guān)研究。
　　 入選患幾分兩組，各12例，入選條件同第一部分，設(shè)膽道閉鎖患兒為病例組，淤膽型嬰兒肝炎患兒為對照組；采集這兩組患兒的血清，同組內(nèi)樣品等體積混合后，采用安捷倫公司的High Capacity Multiple Affinity Remov

10、al System for theDepletion of High-Abundant Proteins from Human Proteomic Samples試劑盒，有效去除血清6種高豐度蛋白，在同等蛋白質(zhì)上樣量的條件下，參考膠圖譜點數(shù)可至2000多個點；進(jìn)行雙向凝膠電泳，每組均跑3塊膠，Imagemaster2D6.0凝膠圖像軟件分析兩組患兒血清蛋白質(zhì)圖譜，發(fā)現(xiàn)17個異點，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜對差異點進(jìn)行鑒定，通過數(shù)據(jù)

11、庫搜索，去冗余后共鑒定10個蛋白；發(fā)現(xiàn)'SP40，40’、載脂蛋白A-Ⅳ、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、α-1-B糖蛋白等在膽道閉鎖組患兒中高表達(dá)，afamin前體在淤膽型嬰兒肝炎組中高表達(dá)。免疫印跡證實差異蛋白‘Sp40，40’在膽道閉鎖的患兒血清中高表達(dá)，淤膽型嬰兒肝炎血清中低表達(dá)；‘Sp40，40’的初步驗證結(jié)果提示可能為膽道閉鎖早期診斷的潛在血清標(biāo)記物。雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)可發(fā)現(xiàn)膽道閉鎖和淤膽型嬰兒肝炎患兒血清蛋白質(zhì)譜的差異，從而為

12、膽道閉鎖的早期診斷及治療奠定基礎(chǔ)；結(jié)合適當(dāng)?shù)难鍢悠奉A(yù)處理，該技術(shù)可以成為篩選疾病相關(guān)血清標(biāo)記物的有力工具。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究利用了兩種相對穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)的血清蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺：一種是快速、高通量的SELDI-TOF-MS分析；另一種是2-DE聯(lián)合MALDI-TOF-MS/MS分析；兩種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合發(fā)現(xiàn)早期膽道閉鎖患兒和淤膽型嬰兒肝炎患兒血清蛋白質(zhì)表達(dá)譜確實存在差異。
　　 2.應(yīng)用SELDI-

13、TOF-MS分析，在質(zhì)荷比(m/z)1500～30，000Da范圍內(nèi)，檢測出的25個蛋白峰中，比較膽道閉鎖和淤膽型嬰兒肝炎患兒血清蛋白質(zhì)譜的差異，發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比為8677的蛋白質(zhì)峰在膽道閉鎖患兒組中下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0214)。
　　 3.應(yīng)用2-DE聯(lián)合MALDI-TOF-MS/MS分析，在有效去除血清高豐度蛋白的前提下，發(fā)現(xiàn)了兩組患兒血清蛋白質(zhì)譜存在17個差異點，鑒定為10種蛋白質(zhì)，其中免疫印跡證實差異蛋白‘Sp4

14、0，40’在膽道閉鎖的患兒血清中高表達(dá)，淤膽型嬰兒肝炎血清中低表達(dá)；‘Sp40，40’的初步驗證結(jié)果提示可能為膽道閉鎖早期診斷的潛在血清標(biāo)記物。
　　 潛在應(yīng)用價值：
　　 1.2-DE聯(lián)合MALDI-TOF-MS/MS分析發(fā)現(xiàn)了兩組患兒血清表達(dá)譜中存在10種差異蛋白，免疫印跡證實差異蛋白‘Sp40，40’表達(dá)存在差異；發(fā)現(xiàn)的差異蛋白有可能成為膽道閉鎖早期診斷的標(biāo)志物及早期干預(yù)的指標(biāo)，豐富了膽道閉鎖早期診斷指標(biāo)的選擇和組