白癜風血清相關因子的蛋白質組學篩選鑒定和致病作用研究.pdf

1、目的：
　　本實驗擬提出如下問題:白癜風的穩(wěn)定期和進展期的是否有相關蛋白質存在差異？我們預采用兩種不同的蛋白質組學2-DE和iTRAQ來分別檢測白癜風不同分期與健康對照組之間的差異蛋白進行比較分析，及其網絡互作的關系找出新的通路，根據蛋白質組學篩選出的高富集因子進行功能學驗證與蛋白質組學的表達是否一致，并且能否篩選出有意義的因子作為血清生物標志物？通過蛋白質組學篩選和臨床總結進一步提出一個假說:帶狀皰疹病毒能否成為誘因作為抗原肽段

2、通過T淋巴細胞識別發(fā)生級聯反應引起黑色素細胞的脫失導致白癜風？為解決上述問題，本實驗首先利用蛋白質組學技術篩選鑒定出白癜風的不同分期的差異蛋白，分析出新的分子功能和通路;其次進一步行白癜風血清中的功能性驗證以找到血清標志物。最后根據蛋白質組學篩查的分子機制對帶狀皰疹病毒是否能作為T淋巴細胞識別抗原的誘因進行探討，為研究白癜風的發(fā)病機制找到新的理論依據。
　　方法：
　　一、2-DE雙向凝膠電泳蛋白質組學篩選
　　采用雙

3、向凝膠電泳技術篩選白癜風不同分期可能相關的血漿差異蛋白。白癜風穩(wěn)定期和進展期各10例與正常組10例分為三組，等量混合不同研究組別的血漿樣品，并采用Clean-Up試劑盒進行預處理后，測定樣品蛋白濃度，用雙向凝膠電泳分離蛋白質，凝膠經過考馬斯亮藍染色后進行凝膠圖像分析。膠內酶解差異蛋白點，并串聯質譜鑒定。
　　二、iTRAQ定量蛋白質組學方法篩選
　　收集白癜風患者穩(wěn)定期和進展期血清各10例與正常對照組血清10例，提蛋白后去除

4、高峰量蛋白，然后用trypsin進行蛋白酶裂解、烷基化、酶解得到肽段。用iTRAQ試劑多重標簽標記肽段，混合后運用離子交換柱分離，最后用MALDI-TOF/TOF質譜鑒定得到差異蛋白。最后通過Uniprot和Cytoskpe軟件進行生物網絡分析，預測差異蛋白在生物網絡中的關系。
　　三、白癜風不同分期相關差異蛋白的Westernblot的表達驗證
　　選擇高富集細胞因子SERPINA5（共同上調）、LUZP4（共同下調）和脂

5、質相關蛋白PON1及APO（載脂蛋白L1和載脂蛋白E），收集白癜風共40例樣本分為穩(wěn)定期和進展期2組和正常組20例進行westernblot蛋白水平驗證，按照蛋白提取法提取血清中蛋白;BCA檢測蛋白濃度;經制膠、跑膠、轉膜、封閉、一抗、二抗、ECL顯色并拍照，觀察蛋白表達變化。
　　四、白癜風不同分期相關差異蛋白Elisa的蛋白水平驗證
　　進一步驗證高富集細胞因子SERPINA5進行酶聯免疫吸附實驗，收集58例白癜風穩(wěn)定期

6、和進展期樣本分為兩組和對照組30例，按照抗原包被、封閉反應、依次加入待測血清樣本、酶標抗體及底物，最后終止液顯色，上機檢測吸收比值的變化。
　　五、白癜風進展期患者的HLA SBT的分型
　　對80例白癜風進展期患者進行HLA-A位點的分型，提取血液樣本的DNA，純化后OD260/280在1.7-1.9之間。擴增基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳確認PCR產物，純化，測序反應ABI3100。
　　六、兩種生物信息學軟件預測V

7、ZV抗原肽段
　　利用SYFPEITHI和BIMAS兩種表位預測軟件，對VZV抗原67個編碼基因在MHC結合位點A*0301上出現的頻率分析給予一定的分值，矩陣法按照分值大小進行排序，在2％最高分的排序預測多肽中可找到最佳預測表位。
　　七、利用ELispot方法篩選帶狀皰疹病毒針對HLA-A3型白癜風的陽性抗原肽段
　　提取白癜風的PBMC細胞與VZV陽性肽段共孵育;用IFN-γ抗體包被，封閉和細胞激活前期準備;洗板

8、，加入分泌性抗體和Streptavidin-HRP室溫孵育，洗板，顯色，Elispot計數儀計數斑點，統計分析。
　　結果：
　　一、兩種蛋白質組學篩選白癜風不同分期的差異蛋白表達
　　1、2-DE篩選白癜風不同分期的差異蛋白表達
　　利用雙向凝膠電泳和質譜分析的蛋白質組學技術篩選白癜風不同分期的差異蛋白表達結果發(fā)現共34個差異蛋白，其中白癜風穩(wěn)定期與正常組相比，差異蛋白表達上調9個，下調6個;進展期與正常組相比

9、，差異蛋白表達上調8個，下調5個;進展期與穩(wěn)定期相比，差異蛋白表達上調5個，下調2個。差異蛋白在進展期和穩(wěn)定期都有的高富集因子包括載脂蛋白APOE，補體C3、C4 C1q等，僅在進展期篩選出的差異蛋白有過氧化物酶6，而進展期與穩(wěn)定期比較的差異蛋白有甘露糖結合蛋白C，補體C4A和C4B。
　　2、iTRAQ篩選白癜風不同分期的差異蛋白表達
　　利用同位素標記的相對和絕對定量的蛋白質組學（iTRAQ）篩選白癜風不同分期的差異蛋白

10、共227個，其中穩(wěn)定期與正常組相比，差異蛋白表達上調42個，下調38個;進展期與正常組相比，差異蛋白表達上調56個，下調33個;進展期與穩(wěn)定期相比，差異蛋白表達上調23個，下調48個。其中，與正常組相比，白癜風的不同分期篩選出的高富集因子包括絲氨酸蛋白酶抑制劑(SERPINA5)、亮氨酸拉鏈蛋白(LUZP4)、基質蛋白酶(MMP9)和免疫球蛋白輕鏈重鏈等;而僅在白癜風穩(wěn)定期篩選得到的高富集因子包括PLCH2、維生素D結合蛋白GC和PON

11、1;僅在進展期篩選得到的高富集因子包括共激活蛋白(COTL1)、S100A9、S100A8、補體C9等。
　　3、分析白癜風不同分期的差異蛋白所表達的四種功能。
　　與對照組相比，根據差異倍數＞1.5的標準分析得到:在穩(wěn)定期和進展期白癜風的差異蛋白所代表的分子功能除了免疫調節(jié)和氧化失衡等功能，還包括磷脂酰膽堿結合、絲氨酸蛋白酶抑制劑活化等發(fā)揮作用;另外還包括B細胞受體信號通路、吞噬作用、凝集素通路、內源性免疫作用、纖維蛋白溶

12、解負調控等生物過程中的影響;細胞組分如補體和凝血級聯成分、IgA免疫球蛋白參與、細胞質Ca2+的反應;還分析發(fā)現脂質代謝、Syndecan-4通絡、FOXA2轉錄以及PPAR信號通路的富集作用等。而白癜風的不同分期在分子功能上的區(qū)別包括穩(wěn)定期的低密度脂蛋白結合、蛋白多糖合成和進展期的Toll樣受體4結合和花生四烯酸結合;在生物過程中的區(qū)別包括穩(wěn)定期表達的內吞和Fc受體信號通路的吞噬以及進展期的急性期免疫反應;而在通路富集的區(qū)別包括穩(wěn)定期

13、的PPAR信號通路和進展期的amb2整合通路。
　　二、白癜風不同分期的差異因子的蛋白水平驗證
　　1、共同表達下調蛋白LUZP4蛋白水平的驗證
　　60例樣本共分白癜風穩(wěn)定期、進展期和正常組共3組。
　　LUZP4:與正常組比較，差異蛋白下調最明顯的LUZP4的蛋白印跡表達結果表明，穩(wěn)定期和進展期的蛋白表達強度降低與蛋白質組學結果一致。(P＜0.05)
　　2、共同表達上調SERPINA5蛋白水平的驗證<

14、br>　　60例樣本共分白癜風穩(wěn)定期、進展期和正常組共3組。SERPINA5蛋白的驗證結果表明:免疫印跡實驗結果顯示，SERPINA5在穩(wěn)定期和進展期的蛋白表達水平均降低，與蛋白質組學結果不一致但差異無統計學意義。進一步對SERPINA5蛋白進行ELISA驗證各28例樣本共分白癜風穩(wěn)定期、進展期和30例正常組共3組，3次重復結果。結果表明，與正常組相比，穩(wěn)定期的SERPINA5的蛋白濃度升高，且差異有統計學意義。(P＜0.05)

15、　　3、脂質相關的差異蛋白驗證
　　對脂質相關差異蛋白PON1和APOE結果表明:與正常組相比，PON1和APOE在白癜風穩(wěn)定期和進展期的蛋白印跡反應強度均降低，與蛋白質組學篩查結果一致。且PON1在白癜風進展期的表達水平降低顯著，有統計學意義(P＜0.05)。而與正常組相比，APOL1在白癜風的穩(wěn)定期的蛋白印跡表達強度無明顯變化，無統計學意義。經Spearman相關性分析發(fā)現，PON1和APOE之間并無相關性。
　　三、帶

16、狀皰疹病毒抗原肽段刺激CTL細胞免疫識別
　　1、VZV抗原陽性肽段的篩選
　　選擇80例進展期白癜風患者中PCR檢測HLAA分型排名前三的HLA-A*0301，生物信息學軟件預測了VZV抗原的63條肽段。選擇12例A0301分型的進展期白癜風患者通過ELISOT方法篩選得到7個陽性肽段，其中有2個強陽性肽段Gp13(FVY-9 Tetramer)和Gp57(HVY-9 Tetramer)。
　　2、四聚體的功能學驗證

17、
　　合成的兩個四聚體Gp13和Gp57與CD8+T淋巴細胞通過對HLA-A不同分型的進展期白癜風的檢測，得到Gp57的9肽頻數范圍在HLA-A*0301的進展期白癜風患者中占1％～3.6％之間，與非HLA-A*0301相比頻數升高;而激光共聚焦顯微鏡下觀察，兩組均可見雙標陽性的PBMC，呈非特異性。
　　結論：
　　1、首次將定量蛋白質組學應用于白癜風不同分期的血清標志物的研究中，與傳統蛋白質組學結合，具有較高的準確