內(nèi)皮源性活性氧對(duì)門靜脈高壓癥內(nèi)臟動(dòng)脈RhoA-ROCK信號(hào)通路影響的研究.pdf

1、內(nèi)臟高動(dòng)力循環(huán)狀態(tài)相關(guān)的并發(fā)癥如食管胃底靜脈曲張所致大出血是門靜脈高壓癥(portalhypertension，PHT)臨床常見(jiàn)且棘手的難題，是引起PHT病人死亡的重要原兇之一。內(nèi)臟動(dòng)脈對(duì)縮血管物質(zhì)的低反應(yīng)性所導(dǎo)致的血管擴(kuò)張是形成PHT高動(dòng)力循環(huán)狀態(tài)的關(guān)鍵，其原因在于血管平滑肌收縮信號(hào)通路發(fā)生障礙。研究顯示，提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，也不能改變PHT內(nèi)臟血管對(duì)縮血管物質(zhì)的低反應(yīng)性，由此說(shuō)明RhoA/ROCK通路可能也同時(shí)參與了該機(jī)制。同時(shí)還

2、發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激參與了PHT內(nèi)臟高動(dòng)力循環(huán)的形成，抗氧化劑在緩解PHT血管擴(kuò)張、高動(dòng)力循環(huán)中的作用越來(lái)越受到重視。但是，關(guān)于活性氧(ROS)在PHT內(nèi)臟動(dòng)脈對(duì)縮血管物質(zhì)的低反應(yīng)性以及高動(dòng)力循環(huán)中作用的相關(guān)研究較少，而且現(xiàn)有報(bào)道均未對(duì)氧化應(yīng)激在PHT內(nèi)臟動(dòng)脈對(duì)縮血管物質(zhì)低反應(yīng)性中的具體作用機(jī)制作深入研究。
　　在本研究中，我們首采用肌肉注射四氯化碳(CCl4)制備肝硬化PHT大鼠模型，顯微鏡下分離腸系膜微動(dòng)脈，檢測(cè)離體腸系膜微動(dòng)脈對(duì)縮

3、血管物質(zhì)反應(yīng)性的變化，然后將保留內(nèi)皮細(xì)胞的PHT微動(dòng)脈與去內(nèi)皮細(xì)胞正常大鼠微動(dòng)脈串聯(lián)，在恒定血管內(nèi)壓、內(nèi)流下系統(tǒng)地測(cè)定從PHT內(nèi)皮細(xì)胞釋放的血管活性物質(zhì)尤其是ROS對(duì)下游正常血管平滑肌的收縮反應(yīng)性和RhoA/ROCK通路的影響。最后，通過(guò)降低PHT腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS的合成和分泌后，觀察肝硬化PHT大鼠的離體腸系膜微動(dòng)脈收縮反應(yīng)性的變化，探討其對(duì)RhoA/ROCK通路的作用機(jī)制。通過(guò)上述研究，有助于完善微動(dòng)脈收縮信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制研究

4、，為臨床治療門靜脈高壓癥血流動(dòng)力學(xué)紊亂提供理論依據(jù)和新的思路。
　　第一部分肝硬化PHT大鼠腸系膜微動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素收縮反應(yīng)性的變化
　　目的:檢測(cè)肝硬化PHT大鼠腸系膜微動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素反應(yīng)性的變化，以及該現(xiàn)象是否與微動(dòng)脈釋放的血管活性物質(zhì)改變有關(guān)。方法:制備肝硬化PHT大鼠模型，術(shù)中測(cè)定門靜脈壓力，分離第三級(jí)微動(dòng)脈，分別利用單根或串聯(lián)血管灌流系統(tǒng)測(cè)定腸系膜微動(dòng)脈去內(nèi)皮前后對(duì)去甲腎上腺素的反應(yīng)。結(jié)果:①成功制備肝硬化P

5、HT大鼠模型。②肝硬化PHT大鼠門靜脈壓力(15.1±1.6)mmHg，遠(yuǎn)高于對(duì)照組大鼠(5.9±0.9)mmHg(P＜0.01)。③肝硬化PHT大鼠的離體腸系膜微動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素劑量反應(yīng)曲線右移，EC50高于對(duì)照組，表明PHT大鼠的腸系膜動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素的敏感程度降低(P＜0.01)。④肝硬化PHT大鼠的離體腸系膜微動(dòng)脈能使下游去內(nèi)皮正常鼠微動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素劑量反應(yīng)曲線右移，EC50升高，表明肝硬化PHT大鼠腸系膜微動(dòng)脈內(nèi)皮釋放

6、的某些血管活性物質(zhì)作用于正常大鼠的微動(dòng)脈平滑肌，使之對(duì)去甲腎上腺素的敏感程度降低(P＜0.01)。結(jié)論:CCl4致肝硬化PHT大鼠腸系膜微動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素的收縮反應(yīng)性降低，這與PHT大鼠微動(dòng)脈內(nèi)皮增加或減少某些血管活性物質(zhì)的釋放有關(guān)。
　　第二部分肝硬化PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈RhoA/ROCK通路相關(guān)基因蛋白表達(dá)及酶活性測(cè)定
　　目的:通過(guò)比較肝硬化PHT大鼠和對(duì)照組大鼠腸系膜動(dòng)脈RhoA/ROCK通路相關(guān)蛋白及酶活性的改變

7、，探討RhoA/ROCK通路在PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素收縮低反應(yīng)中的作用。方法:應(yīng)用免疫印跡法分別檢測(cè)兩組腸系膜動(dòng)脈RhoA/ROCK通路中α1腎上腺素能受體、Gαq/11、Gα12、Gα13、β-arrestin-2、RhoA和ROCK-1蛋白水平變化，以及moesin和p-moesin蛋白量的變化。應(yīng)用免疫共沉淀法檢測(cè)兩組腸系膜動(dòng)脈α1腎上腺素能受體與β-arrestin-2相互作用狀況。結(jié)果:①與對(duì)照組相比，肝硬化PHT

8、大鼠腸系膜動(dòng)脈α1腎上腺素能受體、Gαq/11、Gα12、Gα13、RhoA和ROCK-1蛋白含量無(wú)明顯變化(P＞0.05)，ROCK-1蛋白酶的活性也無(wú)明顯變化(P＞0.05)。②與對(duì)照組大鼠相比較，肝硬化PHT大鼠的腸系膜動(dòng)脈β-arrestin-2蛋白量的表達(dá)升高非常明顯(P＜0.01)。③與對(duì)照組大鼠相比較，肝硬化PHT大鼠的腸系膜動(dòng)脈α1腎上腺素能受體與β-arrestin-2相互作用和結(jié)合的程度顯著升高(P＜0.05)。結(jié)論

9、:CCl4致肝硬化PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈α1腎上腺素能受體、相關(guān)G蛋白以及RhoA、ROCK在蛋白水平?jīng)]有發(fā)生變化，ROCK的活性也未改變，但是β-arrestin-2蛋白水平上升，并且與α1腎上腺素能受體結(jié)合能力增強(qiáng)。
　　第三部分內(nèi)皮源性ROS對(duì)肝硬化PHT大鼠腸系膜微動(dòng)脈去甲腎上腺素反應(yīng)性的影響
　　目的:測(cè)定肝硬化PHT和正常大鼠腸系膜動(dòng)脈ROS的表達(dá)狀況，以及降低血管壁內(nèi)ROS的合成和分泌對(duì)血管去甲腎上腺素反應(yīng)性的影

10、響。方法:肝硬化PHT大鼠模型建立后，分別腹腔內(nèi)注射生理鹽水、apocynin(30mg/kg/d)、tempol(30mg/kg/d)和PEG-catalase(10000u/kg/d)共14天，正常大鼠組也相應(yīng)處理。術(shù)中測(cè)定門靜脈壓力，分離第三級(jí)微動(dòng)脈，DHE熒光染色法檢測(cè)血管組織中的ROS的生成，測(cè)定腸系膜動(dòng)脈H2O2含量，分別利用單根或串聯(lián)血管灌流系統(tǒng)測(cè)定腸系膜微動(dòng)脈去內(nèi)皮前后對(duì)去甲腎上腺素的反應(yīng)。結(jié)果:①術(shù)中門靜脈壓力測(cè)定顯示

11、PHT鼠無(wú)論是否接受抗氧化劑處理，其門靜脈壓力均顯著高于非PHT大鼠(P＜0.01)。②正常組大鼠腸系膜動(dòng)脈壁內(nèi)膜（內(nèi)皮）、中膜和外膜紅色熒光強(qiáng)度較低，而PHT大鼠血管壁各層的熒光強(qiáng)度明顯升高，經(jīng)apocynin、tempol和PEG-catalse處理后的腸系膜動(dòng)脈各層熒光強(qiáng)度顯著降低(P＜0.01)。熒光強(qiáng)度定量圖顯示PHT組為最高，經(jīng)apocynin、tempol和PEG-catalse處理后熒光強(qiáng)度降低，差異非常顯著(P＜0.0

12、1)。③PHT組腸系膜動(dòng)脈壁內(nèi)H2O2含量顯著高于正常大鼠(P＜0.01)，PHT大鼠經(jīng)apocynin和PEG-catalase處理后，動(dòng)脈內(nèi)H2O2含量顯著降低(P＜0.01)，然而經(jīng)tempol處理后腸系膜動(dòng)脈內(nèi)H2O2含量變化不明顯(P＞0.05)。④肝硬化PHT大鼠的離體腸系膜微動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素劑量反應(yīng)曲線右移，EC50高于正常組，經(jīng)apocynin和PEG-catalse處理后，離體腸系膜微動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素劑量反應(yīng)曲線左

13、移，EC50減小(P＜0.01)，表明經(jīng)apocynin和PEG-catalse處理的肝硬化PHT大鼠的腸系膜動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素的敏感程度增加。而經(jīng)tempol處理后，劑量反應(yīng)曲線和EC50變化不明顯(P＞0.05)，表明tempol不能改變肝硬化PHT大鼠的腸系膜動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素的低反應(yīng)性。⑤肝硬化PHT大鼠的離體腸系膜微動(dòng)脈能使下游去內(nèi)皮正常鼠微動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素劑量反應(yīng)曲線右移，EC50升高，經(jīng)apocynin和PEG-cata

14、lase處理后，能使下游去內(nèi)皮正常鼠微動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素劑量反應(yīng)曲線左移，ECs0降低(P＜0.01)，而經(jīng)tempol處理后，變化不明顯(P＞0.05)。結(jié)論:CCl4致肝硬化PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈以及內(nèi)皮ROS含量升高，抗氧化劑apocynin和PEG-catalase都能降低動(dòng)脈壁和內(nèi)皮O2-和H2O2的含量，從而改善PHT腸系膜動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素的低反應(yīng)性;但是tempol僅能降低動(dòng)脈壁和內(nèi)皮O2-的含量，H2O2水平仍高，PHT

15、腸系膜動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素的反應(yīng)性仍低。H2O2的濃度上升降低了肝硬化PHT腸系膜動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素的反應(yīng)性。
　　第四部分肝硬化PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈ROS對(duì)RhoA/ROCK通路的影響
　　目的:分析抗ROS處理后，肝硬化PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素反應(yīng)性改善的機(jī)制。方法:應(yīng)用免疫印跡法分別檢測(cè)正常大鼠、肝硬化PHT大鼠以及分別經(jīng)apocynin、tempol和PEG-catalase處理后，腸系膜動(dòng)脈α1腎上腺素能受

16、體和β-arrestin-2蛋白量的變化，經(jīng)去甲腎上腺素刺激前后各組腸系膜動(dòng)脈RhoA、ROCK-1、moesin和p-moesin蛋白量的變化。應(yīng)用免疫共沉淀法檢測(cè)各組腸系膜動(dòng)脈α1腎上腺素能受體與β-arrestin-2相互作用狀況。結(jié)果:①各組腸系膜動(dòng)脈的α1腎上腺素能受體含量未發(fā)生明顯變化(p＞0.05)。②經(jīng)apocynin或PEG-catalase處理后，肝硬化PHT大鼠腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)β-arrestin-2蛋白量降低(P＜

17、0.01)，但經(jīng)tempol處理后，PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)β-arrestin-2蛋白變化不明顯(P＞0.05)。③經(jīng)apocynin或PEG-catalase處理后，肝硬化PHT大鼠腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)α1腎上腺素能受體與β-arrestin-2結(jié)合水平降低(P＜0.01)，但經(jīng)tempol處理后，PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)α1腎上腺素能受體結(jié)合β-arrestin-2蛋白變化不明顯(P＞0.05)。④去甲腎上腺素刺激前后各組腸系膜動(dòng)脈RhoA

18、和ROCK-1蛋白量無(wú)明顯變化(P＞0.05)。⑤肝硬化PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈經(jīng)去甲腎上腺素刺激前后moesin和p-moesin蛋白量變化不明顯(p＞0.05)，經(jīng)tempol處理后無(wú)明顯變化(p＞0.05);經(jīng)apocynin或PEG-catalase處理后，肝硬化PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈受去甲腎上腺素刺激前后雖然moesin蛋白量無(wú)明顯變化，但是p-moesin蛋白量明顯升高(p＜0.01);正常大鼠無(wú)論受何種處理，腸系膜動(dòng)脈受去甲腎上

19、腺素刺激前后p-moesin蛋白量均明顯升高(p＜0.01)。結(jié)論:apocynin和PEG-catalase降低腸系膜動(dòng)脈壁內(nèi)β-arrestin-2蛋白量以及與α1腎上腺素能受體間的相互作用，改善了依賴G蛋白的信號(hào)通路傳遞障礙，促使激動(dòng)劑誘導(dǎo)ROCK激活，但不影響RhoA/ROCK信號(hào)通路中RhoA和ROCK蛋白量的變化，tempol無(wú)上述作用。
　　第五部分Y-27632對(duì)內(nèi)皮源性ROS引起PHT腸系膜微動(dòng)脈反應(yīng)性變化的影響

20、
　　目的:探討ROCK在內(nèi)皮源性ROS調(diào)節(jié)大鼠腸系膜動(dòng)脈血管平滑肌收縮能力中的作用。方法:肝硬化PHT和對(duì)照大鼠分別經(jīng)apocynin、tempol和PEG-catalse處理，分離第三級(jí)微動(dòng)脈，經(jīng)過(guò)或未經(jīng)過(guò)Y-27632孵育后，利用單根血管灌流系統(tǒng)測(cè)定腸系膜微動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素反應(yīng)性的變化。結(jié)果:①不管是正常大鼠，還是肝硬化PHT大鼠或經(jīng)抗氧化劑處理的大鼠，Y-27632顯著抑制去甲腎上腺素引起的腸系膜微動(dòng)脈收縮(p＜0.01

21、)。②Y-27632對(duì)肝硬化PHT大鼠的腸系膜微動(dòng)脈收縮抑制能力最強(qiáng)，遠(yuǎn)高于正常大鼠(p＜0.01);經(jīng)Apocynin和PEG-catalase處理后，Y-27632對(duì)肝硬化PHT大鼠微動(dòng)脈收縮抑制能力減弱(p＜0.01)，而tempol不能改變Y-27632對(duì)肝硬化PHT大鼠微動(dòng)脈的收縮抑制能力(p＞0.05)。結(jié)論:①RhoA/ROCK信號(hào)通路參與了大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌的收縮機(jī)制。②腸系膜動(dòng)脈內(nèi)ROS尤其是H2O2的濃度上升，阻礙