基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1-α和心臟去細(xì)胞外基質(zhì)介導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性心肌梗死.pdf

1、前言
　　心肌梗死等心血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病。隨著生活方式的變化，我國冠心病發(fā)病率逐年升高。目前臨床治療冠心病有三大方法:藥物保守治療、經(jīng)皮冠脈支架介入、冠脈搭橋手術(shù)。因?yàn)樾募〉脑偕芰缀鯖]有，以上無論哪種方法都無法使梗死心肌恢復(fù)收縮功能達(dá)到治愈的效果。由于干細(xì)胞的多向分化潛能以及無限增殖分裂等特性，近年來，利用干細(xì)胞治療心肌梗死已經(jīng)成為臨床科研的熱門領(lǐng)域，以及具有廣闊前景的治療選擇。干細(xì)胞種類繁多，目前最有希

2、望應(yīng)用于臨床的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)和心臟干細(xì)胞(cardiacstemcells，CSCs)[1，2,3]。
　　BMSCs是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多相分化潛能的成體干細(xì)胞。由于BMSCs不易引起免疫排斥，易于外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)，而同時(shí)又具有比其他間充質(zhì)干細(xì)胞來源更加廣泛、更加易于分離培養(yǎng)、可自體移植等特點(diǎn)，BMSCs治療越來越受到學(xué)者們的青

3、睞，被認(rèn)為是即將被引入臨床治療的最佳干細(xì)胞。但是由于移植的BMSCs局部存活細(xì)胞少以及向心肌細(xì)胞分化能力低，使得BMSCs應(yīng)用效果受限。解決這一難題，成為干細(xì)胞治療心梗的關(guān)鍵。
　　基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（Stromalcellderivedfactor1，SDF-1）是一種G蛋白偶聯(lián)受體的配體，SDF-1為CXC家族成員。在體內(nèi)SDF-1的形式主要有兩種分別為SDF-1α和SDF-1β，以SDF-1α為主。心肌組織損傷后，外周血中循環(huán)

4、干細(xì)胞數(shù)目明顯增多，外周血中的循環(huán)干細(xì)胞隨著血液循環(huán)可到達(dá)各個(gè)組織器官，而最終會(huì)在哪個(gè)組織器官棲息、增殖分化與SDF-1的作用有關(guān)。已有研究證實(shí)SDF-1能夠促進(jìn)骨髓干細(xì)胞的動(dòng)員，增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力和細(xì)胞黏附到纖維蛋白、間質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞的作用[4]。
　　但作為細(xì)胞因子的SDF-1α并不穩(wěn)定，單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，半衰期短，其易被蛋白酶水解，其蛋白水解活性以及在梗死區(qū)快速的擴(kuò)散限制了其生物作用，如果能將SDF-1α控釋，使其在梗死區(qū)達(dá)到穩(wěn)定的

5、濃度進(jìn)而延長其針對BMSCs作用時(shí)間，這可能是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子輔助BMSCs治療的一個(gè)關(guān)鍵。
　　目前已有多種生物材料應(yīng)用于傳遞生物活性物質(zhì)研究，纖維蛋白[5，6]、膠原[7，8]人工基底膜[9，10]、藻朊酸鹽[11]、自組裝肽[12]、殼聚糖[13]等。但這些材料都不能充分的還原天然ECM的結(jié)構(gòu)及化學(xué)組成[14]。近期已經(jīng)開發(fā)出來源于自體細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）的脫細(xì)胞支架組織并應(yīng)用于細(xì)胞工

6、程學(xué)[15-18]。這種材料單獨(dú)注射于小動(dòng)物的梗死區(qū)域后，能夠促進(jìn)細(xì)胞的滲透并顯示出心梗后的細(xì)胞保護(hù)作用[19,20]。通過多價(jià)粘合劑的肝素介導(dǎo)，ECM與細(xì)胞因子共價(jià)結(jié)合，使其可以作為載體捕捉及釋放細(xì)胞因子，另外，心臟脫細(xì)胞外基質(zhì)作為模擬原生心肌ECM生物及化學(xué)特性的最佳材料[19]，這種滲透性、纖維性的支架組織可以促進(jìn)缺血區(qū)域的滲透性和血管再生[21]。
　　由此，本研究將利用心臟脫細(xì)胞外基質(zhì)作為緩釋載體，采用體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，分

7、三個(gè)部分，以脫細(xì)胞基質(zhì)緩釋基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1對BMSCs作用作為主要研究內(nèi)容，研究BMSCs參與心肌再生的機(jī)理，嘗試不同處理因素干預(yù)BMSCs，以增強(qiáng)BMSCs移植的治療效果，改進(jìn)干細(xì)胞治療方法。
　　關(guān)鍵詞:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;基質(zhì)細(xì)胞衍生因子;脫細(xì)胞基質(zhì);肝素化;緩釋;急性心肌梗死;
　　第一部分脫細(xì)胞基質(zhì)緩釋基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1的體外研究
　　目的
　　用“去細(xì)胞化”制備心臟細(xì)胞外基質(zhì)并進(jìn)行SDF-1α修飾

8、，通過觀察SDF-1α的釋放規(guī)律分析評(píng)價(jià)心臟脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)預(yù)載SDF-1α后的緩釋情況。
　　方法
　　離體心臟取自健康成年大耳兔(2.0±0.5kg)，采用1％十二烷基硫酸鈉(Sodiumdodecylsulfate，SDS)循環(huán)灌注的方法得到脫細(xì)胞心臟纖維骨架并制成勻漿。利用含有2％肝素、2％EDC及1.2％羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液（2-N-mo

9、rpholoinolethanesulfonicacid，MES）中行肝素固化，進(jìn)行SDF-1α修飾。利用ELISA測定3h、6h、24h、96h、168h液體濃度繪制釋放曲線。
　　結(jié)果
　　通過ELISA計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)心臟脫細(xì)胞釋放SDF-1α量，繪制出一條釋放曲線。
　　結(jié)論
　　經(jīng)過ELISA繪制曲線證實(shí)，心臟脫細(xì)胞外基質(zhì)通過肝素化攝取并釋放SDF-1α，其性質(zhì)穩(wěn)定。
　　第二部分脫細(xì)胞基質(zhì)緩釋SD

10、F-1α聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療心肌梗死的效果觀察
　　目的
　　動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)采用SDF-1α預(yù)載肝素固化的心臟脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)與BMSCs共同作用，干預(yù)梗死心肌，觀察其對梗死心肌的治療效果，進(jìn)一步驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　方法
　　選用日本大耳白兔，雌雄不拘，體重2.5±0.5kg，于冠脈前降支中、遠(yuǎn)端1/3交界處阻斷，反復(fù)缺血預(yù)適應(yīng)3次后徹底結(jié)扎，局部心肌顏色變?yōu)榘底仙?。將?shí)驗(yàn)分四組，第一組為單純心梗模型建立的

11、對照組;第二組SDF-1α+脫細(xì)胞基質(zhì)組;第三組BMSCs組;第四組SDF-1α+脫細(xì)胞基質(zhì)+BMSCs組。每組術(shù)后6周心臟超聲進(jìn)行心臟機(jī)械功能分析并取移植區(qū)域組織，采用免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡成像分析移植細(xì)胞表達(dá)cTNT、GATA4等抗原確定心肌細(xì)胞分化。比較分析各組干細(xì)胞分化差異。
　　結(jié)果
　　心肌梗死后，免疫熒光及Masson染色顯示，BMSCs伴隨脫細(xì)胞外基質(zhì)緩釋SDF-1α移植情況下，梗死區(qū)凋亡細(xì)胞明顯減少，且

12、BMSCs表達(dá)cTNT及GATA等明顯升高，聯(lián)合治療組LVEF亦較對照組升高(p＜0.05)。
　　結(jié)論
　　本研究在體證明了聯(lián)合緩釋SDF-1α和BMSCs移植促進(jìn)局部BMSCs存活、抑制凋亡和向心肌細(xì)胞分化，不僅限制了心梗后左室擴(kuò)張，同樣促進(jìn)心功能明顯改善。
　　第三部分脫細(xì)胞基質(zhì)與基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1協(xié)同作用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞機(jī)制的研究
　　目的
　　在體外實(shí)驗(yàn)中觀察SDF-1α與細(xì)胞外基質(zhì)與BMSCs

13、聯(lián)合應(yīng)用對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活、增殖能力、遷移、分化等影響，揭示其在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療心肌梗死中的作用機(jī)制;
　　方法
　　體外觀察心臟脫細(xì)胞基質(zhì)與SDF-1α對BMSCs的協(xié)同作用。體外增殖、遷移、分化和凋亡評(píng)價(jià):用脫細(xì)胞基質(zhì)、SDF-1α、脫細(xì)胞基質(zhì)+SDF-1α刺激BMSCs，利用阿爾瑪藍(lán)法檢測細(xì)胞增殖;transwell小室觀察細(xì)胞遷移;采用Westernblot及免疫熒光等技術(shù)測定cTNT、GATA4等評(píng)價(jià)心肌細(xì)

14、胞分化;利用缺氧誘導(dǎo)BMSCs凋亡，使用流式細(xì)胞儀(AnexinⅤ/PI)雙染定量檢測。
　　結(jié)果
　　心臟脫細(xì)胞外基質(zhì)緩釋SDF-1α組的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖明顯，比對照組、SDF、單純心臟脫細(xì)胞外基質(zhì)組有明顯差異(p＜0.05)。針對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)凋亡后行流式細(xì)胞儀檢測，相對對照組，心臟脫細(xì)胞外基質(zhì)緩釋SDF-1α可以明顯抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的早期及晚期凋亡(p＜0.01)并且在transwell實(shí)驗(yàn)中提高其遷