含甲氧基黃酮類化合物UGT代謝特征及其機理研究.pdf

1、黃酮類化合物在體內的代謝情況復雜,廣泛存在的葡萄糖醛酸化代謝、硫酸化代謝,是導致其生物利用度低的重要因為；其中,經尿苷二磷酸葡萄糖苷酸轉移酶(UDP-Glucuronosyl transferases,UGTs)催化的葡萄糖醛酸化反應是主要的代謝途徑。以往研究表明,黃酮類化合物的葡萄糖醛酸化代謝具有一定的底物特異性,該代謝受到其復雜化學結構變化如甲氧基、羥基變化影響,其中羥基變化對于黃酮類化合物葡萄糖醛酸化代謝的影響研究較多:此外,最近

2、發(fā)現含甲氧基黃酮所具有的化學預防能力往往優(yōu)于非甲氧基黃酮類化合物。因此,本論文重點研究含甲氧基黃酮類化合物的葡萄糖醛酸化代謝特征及機理。
　　 為了研究含甲氧基黃酮類化合物的葡萄糖醛酸化代謝規(guī)律,選定了兩個單甲氧基5,7-二羥基黃酮化合物:漢黃芩素(Wogonin)和千層紙黃素(Oroxylin A),以及三個含甲氧基5-單羥基黃酮化合物:楊芽黃素(Tectochrysin,5-hydroxy-7-methoxy flavone

3、,5H7MF)、5-羥基-7,8-二甲氧基黃酮(5-hydroxy-7,8-dimethoxyflavone,5H7,8MF)、5-羥基-6,7,8,4’-四甲氧基黃酮(5-hydroxy-6,7,8,4’-tetramethoxy flavone,5H6,7,8,4'MF)做為模型化合物。其中,前兩個化合物含兩個酚羥基,結構中甲氧基位置有微小變化；而后三個化合物含單個酚羥基,A環(huán)上所含甲氧基數量依次遞增。擬用12種商品化人源重組UGT

4、酶以及人體肝、腸微粒體,在體外對這五個化合物進行系統(tǒng)葡萄糖醛酸化代謝研究,尋找出其代謝規(guī)律、代謝特征,并擬達到以下目的:1、對這些化合物進行葡萄糖醛酸化代謝特征研究,得到其UGT。酶特異性代謝指紋圖譜(UGT-isoform specificmetabolic fingerprint,GSMF)。2、分析UGT酶代謝行為特征,尋找其與人體主要代謝器官肝、腸的葡萄糖醛酸化代謝情況之間的相關性,并運用UGT酶催化的葡萄糖醛酸化代謝特征對肝、

5、腸特異性葡萄糖醛酸化代謝情況進行預測。3、分析化學結構變化如甲氧基位置、數量變化,對模型化合物UGT酶特異性代謝特征的影響。
　　 主要研究方法如下:
　　 一、人肝、腸微粒體和人源UGT酶的酶活性實驗
　　 為了得到各模型黃酮化合物的GSMF,重要UGT的特異性代謝動力學情況及器官特異性葡萄糖醛酸化代謝情況,在體外運用器官微粒體和UGT酶測定酶活性。酶孵育實驗步驟如下:(1)混合微粒體或UGT酶(反應最佳終濃度

6、范圍是0.0053～0.053毫克蛋白每毫升)、氯化鎂0.88 mM、葡糖二酸單內酯4.4 mM、丙甲菌素0.022 mg/ml；含有不同濃度底物的50 mM磷酸氫二鉀溶液(pH 7.4)；以及UDPGA(3.5 mM)。(2)將混合后終體積為680 μl的混合物平均分以得三等份,每份200 μl,置于37℃按預設時間(10至60 min)同時孵育。(3)加入內含90 μM苯乙酮的94％乙腈6％醋酸溶液(作內標,其中漢黃芩素、千層紙黃素

7、、5H6,7,8,4’MF用苯乙酮,而5H7MF、5H7,8MF換為苯丙酮)終止反應。終止反應后的混合液于13,000 rpm離心15分鐘,取上清液進行UPLC分析。
　　 測定GSMF時,僅采用了高、中、低三個底物濃度2.5,10以及35 μM。描繪UGT代謝動力學情況時,如UGT 1A1,1A3,1A7-1A10對漢黃芩素、千層紙黃素代謝情況,采用了1.25-35μM(0.5-35 μM)范圍內9-11個底物濃度。
　

8、　 二、UPLC分析方法
　　 為了對各模型化合物及代謝產物進行分析定量,采用了以下UPLC方法:對于漢黃芩素、千層紙黃素及其相應葡萄糖醛酸化代謝物,分析系統(tǒng)為WatersAcquity UPLC,采用光二極管陣列檢測器(DAD)及Empower軟件。分離柱為BEH C18,1.7 μm,2.1×50 mm。流動相B為100％乙腈,流動相A為0.1％(v/v)甲酸水溶液(pH 2.5)。流速為0.4 ml/min,采用梯度洗脫

9、,0～1.5分鐘時,流動相B占30-40％;1.5～2.5分鐘時,流動相B占40-70％；2.5～3.0分鐘時,流動相B占70-30％。檢測波長280 nm,注入樣品體積10μl。對于楊芽黃素、5-羥基-7,8-二甲氧基黃酮、5-羥基-6,7,8,4’-四甲氧基黃酮及其代謝物的UPLC分析定量方法與以上方法大體一致,不同之處僅在于梯度洗脫方法變?yōu)?0～1.5分鐘時,流動相B占30-40％；1.5～3.0分鐘時,流動相B占40-90％；3

10、.0～4.0分鐘時,流動相B占90-30％。
　　 為了確保各模型化合物在實驗過程中穩(wěn)定,還進行了穩(wěn)定性實驗。在高、中、低三個濃度40 μM,10 μM和1.25 μM(2.5 μM)條件下,為每個化合物的分析方法做了日內及日間差異驗證。
　　 三、所選黃酮化合物葡萄糖醛酸化代謝物轉化因子測定方法
　　 為了準確地測定轉化因子K值,從而進一步準確定量各葡萄糖醛酸化代謝產物,本研究采用了以下方法測定轉化因子K值:(

11、1)對于5,7-二羥基黃酮:漢黃芩素、千層紙黃素,選用了活性最強的UGT酶對底物進行葡萄糖醛酸化反應。其它5位單羥基黃酮則采用了大鼠微粒體來進行此過程。(2)用二氯甲烷萃取兩次除去苷元(水相樣品/二氯甲烷為2:5,v/v),葡萄糖醛酸苷存在于水相樣品中。(3)將水相樣品等分為兩份,其中一份直接進行UPLC分析,另一份經β-葡萄糖醛酸苷酶(800 units/ml)在37℃水解。水解時間分別是:漢黃芩素水相樣品1小時,千層紙黃素樣品10小

12、時,楊芽黃素、5-羥基-7,8-二甲氧基黃酮樣品各12小時。將水解前后兩份樣品相比較,用苷峰面積的減少量除以苷元峰面積的增加量,而間接測得各轉化因子值。
　　 四、考察各個分析條件對轉化因子K值的影響。
　　 為了控制分析過程中各個分析條件對轉化因子測定準確性的影響,進一步考察了實驗過程中下列分析條件對轉化因子K值測定的影響:流動相pH值、離子強度、樣品介質pH值、檢測波長。利用上述配制的漢黃芩素、漢黃芩苷系列標準溶液,

13、逐個改變上述分析條件,并在改變某個條件時保持其它條件不變,觀察AWG:AW比值的變化情況。
　　 五、應用LC-MS/MS推測所選黃酮化合物對應葡萄糖醛酸化代謝物的結構
　　 為了進一步推測所選模型黃酮化合物經代謝后產生葡萄糖醛酸化代謝物的結構,采用超高效液相-電噴霧-質譜/質譜(UPLC-ESI-MSn)方法對黃酮及其葡萄糖醛酸化代謝物進行分離、檢測以及分析,運用正離子方式檢測,各黃酮及其苷的分離色譜條件與UPLC相同

14、。
　　 六、酶動力學數據分析
　　 為了得出漢黃芩素、千層紙黃素的UGT代謝動力學情況及兩者在肝、腸的葡萄糖醛酸化動力學情況,將酶活性實驗所得動力學數據進行分析。
　　 七、運用UGT酶預測人肝、腸微粒體中黃酮葡萄糖醛酸化反應規(guī)律
　　 為了預測模型黃酮化合物在人肝、腸微粒體中葡萄糖醛酸化代謝情況,結合UGT在各組織中表達情況及各UGT對化合物代謝的貢獻大小,采用了以下方法:先經研究得出代謝黃酮化合物的

15、主要UGT酶；接著參考各UGT在肝、腸中表達水平將幾種起主要代謝作用的UGT聯(lián)合起來,即運用加權平均方法計算這幾種UGT葡萄糖醛酸化反應速率的平均值,用以預測該化合物在肝、腸微粒體中的代謝情況。再接下來,畫出對應Eadie-Hofstee圖以及縱軸為葡萄糖醛酸化反應聯(lián)合速率、橫軸為黃酮化合物濃度的葡萄糖醛酸化反應速率變化情況圖,并獲得各個表觀動力學參數。
　　 八、統(tǒng)計學分析
　　 標準曲線采用線性回歸分析；以UGT數據

16、與肝微粒體數據擬合采用線性相關分析；其他數據采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析處理,實驗數據用均數±標準差(Mean±SD)表示；獨立樣本數據用One-Way ANOVA檢驗。組間多重比較采用Tukey法,方差不齊的采用Tamhane's T2法,顯著性標準為α=0.05。
　　 綜上所述,本研究在體外測定得到五個含甲氧基化合物的UGT酶特異性代謝指紋圖譜,即參與兩個5,7-二羥基黃酮化合物漢黃芩素、千層紙黃素代謝的UGT主要為U

17、GT1A3及UGT1A7-1A10；在三個5-羥基黃酮化合物之中,5H6,7,8,4’MF未發(fā)現代謝物,參與5H7MF、5H7,8MF代謝的UGT主要為UGT1Al、1A3及UGT1A7-1A10。GSMF及UGT酶特異性代謝情況可以用來預測兩個5,7-二羥基黃酮化合物在人體肝、腸,以及5H7,8MF、5H7MF、5H6,7,8,4’MF在人體肝的葡萄糖醛酸化代謝情況。同時,發(fā)現隨著漢黃芩素、千層紙黃素之間微小的甲氧基取代位置變化,即由