含甲氧基黃酮類化合物UGT代謝特征及其機(jī)理研究.pdf

1、黃酮類化合物在體內(nèi)的代謝情況復(fù)雜,廣泛存在的葡萄糖醛酸化代謝、硫酸化代謝,是導(dǎo)致其生物利用度低的重要因?yàn)?；其?經(jīng)尿苷二磷酸葡萄糖苷酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-Glucuronosyl transferases,UGTs)催化的葡萄糖醛酸化反應(yīng)是主要的代謝途徑。以往研究表明,黃酮類化合物的葡萄糖醛酸化代謝具有一定的底物特異性,該代謝受到其復(fù)雜化學(xué)結(jié)構(gòu)變化如甲氧基、羥基變化影響,其中羥基變化對(duì)于黃酮類化合物葡萄糖醛酸化代謝的影響研究較多:此外,最近

2、發(fā)現(xiàn)含甲氧基黃酮所具有的化學(xué)預(yù)防能力往往優(yōu)于非甲氧基黃酮類化合物。因此,本論文重點(diǎn)研究含甲氧基黃酮類化合物的葡萄糖醛酸化代謝特征及機(jī)理。
　　 為了研究含甲氧基黃酮類化合物的葡萄糖醛酸化代謝規(guī)律,選定了兩個(gè)單甲氧基5,7-二羥基黃酮化合物:漢黃芩素(Wogonin)和千層紙黃素(Oroxylin A),以及三個(gè)含甲氧基5-單羥基黃酮化合物:楊芽黃素(Tectochrysin,5-hydroxy-7-methoxy flavone

3、,5H7MF)、5-羥基-7,8-二甲氧基黃酮(5-hydroxy-7,8-dimethoxyflavone,5H7,8MF)、5-羥基-6,7,8,4’-四甲氧基黃酮(5-hydroxy-6,7,8,4’-tetramethoxy flavone,5H6,7,8,4'MF)做為模型化合物。其中,前兩個(gè)化合物含兩個(gè)酚羥基,結(jié)構(gòu)中甲氧基位置有微小變化；而后三個(gè)化合物含單個(gè)酚羥基,A環(huán)上所含甲氧基數(shù)量依次遞增。擬用12種商品化人源重組UGT

4、酶以及人體肝、腸微粒體,在體外對(duì)這五個(gè)化合物進(jìn)行系統(tǒng)葡萄糖醛酸化代謝研究,尋找出其代謝規(guī)律、代謝特征,并擬達(dá)到以下目的:1、對(duì)這些化合物進(jìn)行葡萄糖醛酸化代謝特征研究,得到其UGT。酶特異性代謝指紋圖譜(UGT-isoform specificmetabolic fingerprint,GSMF)。2、分析UGT酶代謝行為特征,尋找其與人體主要代謝器官肝、腸的葡萄糖醛酸化代謝情況之間的相關(guān)性,并運(yùn)用UGT酶催化的葡萄糖醛酸化代謝特征對(duì)肝、

5、腸特異性葡萄糖醛酸化代謝情況進(jìn)行預(yù)測(cè)。3、分析化學(xué)結(jié)構(gòu)變化如甲氧基位置、數(shù)量變化,對(duì)模型化合物UGT酶特異性代謝特征的影響。
　　 主要研究方法如下:
　　 一、人肝、腸微粒體和人源UGT酶的酶活性實(shí)驗(yàn)
　　 為了得到各模型黃酮化合物的GSMF,重要UGT的特異性代謝動(dòng)力學(xué)情況及器官特異性葡萄糖醛酸化代謝情況,在體外運(yùn)用器官微粒體和UGT酶測(cè)定酶活性。酶孵育實(shí)驗(yàn)步驟如下:(1)混合微粒體或UGT酶(反應(yīng)最佳終濃度

6、范圍是0.0053～0.053毫克蛋白每毫升)、氯化鎂0.88 mM、葡糖二酸單內(nèi)酯4.4 mM、丙甲菌素0.022 mg/ml；含有不同濃度底物的50 mM磷酸氫二鉀溶液(pH 7.4)；以及UDPGA(3.5 mM)。(2)將混合后終體積為680 μl的混合物平均分以得三等份,每份200 μl,置于37℃按預(yù)設(shè)時(shí)間(10至60 min)同時(shí)孵育。(3)加入內(nèi)含90 μM苯乙酮的94％乙腈6％醋酸溶液(作內(nèi)標(biāo),其中漢黃芩素、千層紙黃素

7、、5H6,7,8,4’MF用苯乙酮,而5H7MF、5H7,8MF換為苯丙酮)終止反應(yīng)。終止反應(yīng)后的混合液于13,000 rpm離心15分鐘,取上清液進(jìn)行UPLC分析。
　　 測(cè)定GSMF時(shí),僅采用了高、中、低三個(gè)底物濃度2.5,10以及35 μM。描繪UGT代謝動(dòng)力學(xué)情況時(shí),如UGT 1A1,1A3,1A7-1A10對(duì)漢黃芩素、千層紙黃素代謝情況,采用了1.25-35μM(0.5-35 μM)范圍內(nèi)9-11個(gè)底物濃度。
　

8、　 二、UPLC分析方法
　　 為了對(duì)各模型化合物及代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析定量,采用了以下UPLC方法:對(duì)于漢黃芩素、千層紙黃素及其相應(yīng)葡萄糖醛酸化代謝物,分析系統(tǒng)為WatersAcquity UPLC,采用光二極管陣列檢測(cè)器(DAD)及Empower軟件。分離柱為BEH C18,1.7 μm,2.1×50 mm。流動(dòng)相B為100％乙腈,流動(dòng)相A為0.1％(v/v)甲酸水溶液(pH 2.5)。流速為0.4 ml/min,采用梯度洗脫

9、,0～1.5分鐘時(shí),流動(dòng)相B占30-40％;1.5～2.5分鐘時(shí),流動(dòng)相B占40-70％；2.5～3.0分鐘時(shí),流動(dòng)相B占70-30％。檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm,注入樣品體積10μl。對(duì)于楊芽黃素、5-羥基-7,8-二甲氧基黃酮、5-羥基-6,7,8,4’-四甲氧基黃酮及其代謝物的UPLC分析定量方法與以上方法大體一致,不同之處僅在于梯度洗脫方法變?yōu)?0～1.5分鐘時(shí),流動(dòng)相B占30-40％；1.5～3.0分鐘時(shí),流動(dòng)相B占40-90％；3

10、.0～4.0分鐘時(shí),流動(dòng)相B占90-30％。
　　 為了確保各模型化合物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中穩(wěn)定,還進(jìn)行了穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。在高、中、低三個(gè)濃度40 μM,10 μM和1.25 μM(2.5 μM)條件下,為每個(gè)化合物的分析方法做了日內(nèi)及日間差異驗(yàn)證。
　　 三、所選黃酮化合物葡萄糖醛酸化代謝物轉(zhuǎn)化因子測(cè)定方法
　　 為了準(zhǔn)確地測(cè)定轉(zhuǎn)化因子K值,從而進(jìn)一步準(zhǔn)確定量各葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物,本研究采用了以下方法測(cè)定轉(zhuǎn)化因子K值:(

11、1)對(duì)于5,7-二羥基黃酮:漢黃芩素、千層紙黃素,選用了活性最強(qiáng)的UGT酶對(duì)底物進(jìn)行葡萄糖醛酸化反應(yīng)。其它5位單羥基黃酮?jiǎng)t采用了大鼠微粒體來(lái)進(jìn)行此過(guò)程。(2)用二氯甲烷萃取兩次除去苷元(水相樣品/二氯甲烷為2:5,v/v),葡萄糖醛酸苷存在于水相樣品中。(3)將水相樣品等分為兩份,其中一份直接進(jìn)行UPLC分析,另一份經(jīng)β-葡萄糖醛酸苷酶(800 units/ml)在37℃水解。水解時(shí)間分別是:漢黃芩素水相樣品1小時(shí),千層紙黃素樣品10小

12、時(shí),楊芽黃素、5-羥基-7,8-二甲氧基黃酮樣品各12小時(shí)。將水解前后兩份樣品相比較,用苷峰面積的減少量除以苷元峰面積的增加量,而間接測(cè)得各轉(zhuǎn)化因子值。
　　 四、考察各個(gè)分析條件對(duì)轉(zhuǎn)化因子K值的影響。
　　 為了控制分析過(guò)程中各個(gè)分析條件對(duì)轉(zhuǎn)化因子測(cè)定準(zhǔn)確性的影響,進(jìn)一步考察了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中下列分析條件對(duì)轉(zhuǎn)化因子K值測(cè)定的影響:流動(dòng)相pH值、離子強(qiáng)度、樣品介質(zhì)pH值、檢測(cè)波長(zhǎng)。利用上述配制的漢黃芩素、漢黃芩苷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,

13、逐個(gè)改變上述分析條件,并在改變某個(gè)條件時(shí)保持其它條件不變,觀察AWG:AW比值的變化情況。
　　 五、應(yīng)用LC-MS/MS推測(cè)所選黃酮化合物對(duì)應(yīng)葡萄糖醛酸化代謝物的結(jié)構(gòu)
　　 為了進(jìn)一步推測(cè)所選模型黃酮化合物經(jīng)代謝后產(chǎn)生葡萄糖醛酸化代謝物的結(jié)構(gòu),采用超高效液相-電噴霧-質(zhì)譜/質(zhì)譜(UPLC-ESI-MSn)方法對(duì)黃酮及其葡萄糖醛酸化代謝物進(jìn)行分離、檢測(cè)以及分析,運(yùn)用正離子方式檢測(cè),各黃酮及其苷的分離色譜條件與UPLC相同

14、。
　　 六、酶動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析
　　 為了得出漢黃芩素、千層紙黃素的UGT代謝動(dòng)力學(xué)情況及兩者在肝、腸的葡萄糖醛酸化動(dòng)力學(xué)情況,將酶活性實(shí)驗(yàn)所得動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
　　 七、運(yùn)用UGT酶預(yù)測(cè)人肝、腸微粒體中黃酮葡萄糖醛酸化反應(yīng)規(guī)律
　　 為了預(yù)測(cè)模型黃酮化合物在人肝、腸微粒體中葡萄糖醛酸化代謝情況,結(jié)合UGT在各組織中表達(dá)情況及各UGT對(duì)化合物代謝的貢獻(xiàn)大小,采用了以下方法:先經(jīng)研究得出代謝黃酮化合物的

15、主要UGT酶；接著參考各UGT在肝、腸中表達(dá)水平將幾種起主要代謝作用的UGT聯(lián)合起來(lái),即運(yùn)用加權(quán)平均方法計(jì)算這幾種UGT葡萄糖醛酸化反應(yīng)速率的平均值,用以預(yù)測(cè)該化合物在肝、腸微粒體中的代謝情況。再接下來(lái),畫出對(duì)應(yīng)Eadie-Hofstee圖以及縱軸為葡萄糖醛酸化反應(yīng)聯(lián)合速率、橫軸為黃酮化合物濃度的葡萄糖醛酸化反應(yīng)速率變化情況圖,并獲得各個(gè)表觀動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
　　 八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 標(biāo)準(zhǔn)曲線采用線性回歸分析；以UGT數(shù)據(jù)

16、與肝微粒體數(shù)據(jù)擬合采用線性相關(guān)分析；其他數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示；獨(dú)立樣本數(shù)據(jù)用One-Way ANOVA檢驗(yàn)。組間多重比較采用Tukey法,方差不齊的采用Tamhane's T2法,顯著性標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05。
　　 綜上所述,本研究在體外測(cè)定得到五個(gè)含甲氧基化合物的UGT酶特異性代謝指紋圖譜,即參與兩個(gè)5,7-二羥基黃酮化合物漢黃芩素、千層紙黃素代謝的UGT主要為U

17、GT1A3及UGT1A7-1A10；在三個(gè)5-羥基黃酮化合物之中,5H6,7,8,4’MF未發(fā)現(xiàn)代謝物,參與5H7MF、5H7,8MF代謝的UGT主要為UGT1Al、1A3及UGT1A7-1A10。GSMF及UGT酶特異性代謝情況可以用來(lái)預(yù)測(cè)兩個(gè)5,7-二羥基黃酮化合物在人體肝、腸,以及5H7,8MF、5H7MF、5H6,7,8,4’MF在人體肝的葡萄糖醛酸化代謝情況。同時(shí),發(fā)現(xiàn)隨著漢黃芩素、千層紙黃素之間微小的甲氧基取代位置變化,即由