HuCD100-Fcε融合蛋白的構(gòu)建及其對肥大細(xì)胞的作用.pdf

1、由于工業(yè)化和城市化的不斷深入以及環(huán)境污染的加重等原因,近年來全球范圍內(nèi)變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病率和嚴(yán)重程度迅速增加。據(jù)統(tǒng)計(jì),目前全球有4億過敏性鼻炎患者、3億哮喘患者,其中50％居住在發(fā)展中國家并且未得到有效的治療[1]。世界衛(wèi)生組織(WHO)已將變態(tài)反應(yīng)性疾病列為全球重點(diǎn)防治的疾病。盡管世界各國投入了大量的人力及財(cái)力進(jìn)行深入研究,變態(tài)反應(yīng)性疾病的治療仍非常困難[2]。
　　目前變態(tài)反應(yīng)性疾病的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚,但肥大細(xì)胞(mas

2、tcell,MC)是變態(tài)反應(yīng)中的主要效應(yīng)細(xì)胞,關(guān)于變態(tài)反應(yīng)發(fā)病的效應(yīng)機(jī)制較為明確:變應(yīng)原特異性IgE與變應(yīng)原結(jié)合后交聯(lián)MC表面的IgEFc受體(FcεRI),引起MC脫顆粒、組胺釋放等事件,進(jìn)而導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)癥狀的出現(xiàn)。因此,靶向抑制MC的功能或清除MC是治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的有效策略。近年來有多種MC相關(guān)抑制性免疫調(diào)節(jié)分子及其機(jī)制得到明確,為設(shè)計(jì)新的靶向抑制策略提供了可能。CD72是新近發(fā)現(xiàn)表達(dá)于MC的具有抑制功能的分子,其配體為CD10

3、0。在人MC,CD72通過與可溶型CD100(sCD100)結(jié)合而啟動對Scf/kit介導(dǎo)信號的負(fù)調(diào)控,從而抑制MC增殖、趨化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
　　本研究提出構(gòu)建HuCD100-Fcε融合蛋白靶向MC治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的新策略。HuCD100-Fcε融合蛋白的Fcε段以高親和力結(jié)合并封閉MC表面IgE受體FcεRI,HuCD100識別MC表面受體CD72,通過與CD72結(jié)合而抑制Scf/kit通路的激活,從而影響MC的存活、增殖

4、、趨化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。本研究擬將人CD100cDNA編碼胞膜外區(qū)的基因與人IgE的CH2-CH4基因連接,真核細(xì)胞表達(dá)HuCD100-Fcε融合蛋白,利用表達(dá)FcεRI和CD72的人肥大細(xì)胞系LAD2分析HuCD100-Fcε的結(jié)合活性以及對LAD2的作用。
　　研究目的:
　　1.獲取具有良好生物學(xué)活性的HuCD100-Fcε融合蛋白。
　　2.初步明確HuCD100-Fcε融合蛋白對人肥大細(xì)胞系LAD2的影響。研

5、究內(nèi)容與方法:
　　1.HuCD100-Fcε表達(dá)載體的構(gòu)建:PCR擴(kuò)增人Fcε基因,插入含有人CD100基因的質(zhì)粒HuCD100/pcDNA3.1,構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-HuCD100-Fcε。
　　2.HuCD100-Fcε融合蛋白的瞬時(shí)表達(dá)及鑒定:瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,ELISA、Westernblot檢測融合蛋白的表達(dá)。
　　3.HuCD100-Fcε融合蛋白的穩(wěn)定表達(dá)及鑒定:篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞系

6、,有限稀釋法獲得高表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞株。
　　4.HuCD100-Fcε融合蛋白對人肥大細(xì)胞系LAD2的作用:體外細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)分析HuCD100-Fcε融合蛋白對肥大細(xì)胞系LAD2增殖、脫顆粒的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.獲得了T-vector-Fcε質(zhì)粒和pcDNA3.1-HuCD100-Fcε重組質(zhì)粒,將pcDNA3.1-HuCD100-Fcε重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后,ELISA和Western blot鑒定融合

7、蛋白HuCD100-Fcε成功表達(dá)。
　　2.pcDNA3.1-HuCD100-Fcε重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,獲得了穩(wěn)定表達(dá)HuCD100-Fcε融合蛋白的細(xì)胞系。
　　3.體外實(shí)驗(yàn)證明融合蛋白HuCD100-Fcε能抑制人肥大細(xì)胞系LAD2的脫顆粒和增殖。
　　結(jié)論:
　　本研究首次提出構(gòu)建HuCD100-Fcε融合蛋白治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的新策略,獲得了具有良好結(jié)合活性及生物學(xué)功能的HuCD100-Fcε融