藥物中揮發(fā)性成分樣品前處理方法的研究與應用.pdf

1、藥物中的揮發(fā)性成分的分析測定常需采用一定的樣品前處理方法進行萃取、分離、純化、富集后再利用色譜法測定，以減少干擾成分及對色譜系統(tǒng)的損害等。傳統(tǒng)的萃取純化方法有液液萃取，如揮發(fā)油提取器提取法、水蒸氣蒸餾萃取法、超聲法和索氏提取法等，但這些方法均存在使用大量有機溶劑，提取時間長，提取效率低，操作步驟繁雜，暴露機會較多，易造成揮發(fā)成分的損失，使樣品的信息失真等缺點。近年來，固相萃取及固相微萃取技術雖然已用于藥物中的揮發(fā)性成分的含量測定，但其萃

2、取裝置的萃取頭涂層種類少，價格昂貴，且使用壽命短，多次使用還存在交叉污染的問題。因此，需建立簡單快速、密閉準確、選擇性高、環(huán)境友好的樣品前處理方法用于分析檢測藥物中的揮發(fā)性成分。
　　 近年來項空技術憑借其裝置簡單，成本低，氣體進樣，對色譜系統(tǒng)污染少，且分析速度快，靈敏度高等特點越來越多地應用于藥物中有機溶劑殘留的分析檢測。頂空氣相色譜法(HS-GC)中頂空溶劑的合理選擇是關鍵，一個合適的頂空溶劑首先要溶解藥物及待測成分，其次要

3、有理想的頂空效率，即靈敏度要高。水是最傳統(tǒng)的頂空溶劑，也是水溶性藥物最理想的頂空溶劑，因此，本文首先建立了以水為頂空溶劑的HS-GC分析檢測藿香正氣口服液中乙醇的殘留量的方法，這是因為藥物藿香正氣口服液及待測溶劑乙醇均易溶于水，且水作為頂空溶劑無污染，也避免了使用其他高沸點的頂空溶劑如N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)等時由于在頂空時揮發(fā)產(chǎn)生極大的溶劑峰干擾待測組分的測定。該方法簡單、準確、靈敏，既減少了對待測物的干

4、擾，又不污染色譜系統(tǒng)，適用于藿香正氣口服液中乙醇殘留的含量測定。
　　 雖然水是理想的頂空溶劑，因其對水不溶性待測組分具有憎水作用而表現(xiàn)出良好的頂空效率。針對水不溶性的藥物和待測組分，雖然可以使用的其他的高沸點的傳統(tǒng)頂空溶劑DMF、DMSO等，但它們在頂空時隨待測組分一起揮發(fā)，不僅會產(chǎn)生寬大的色譜峰干擾檢測，其加熱時也不穩(wěn)定會分解產(chǎn)生揮發(fā)性雜質，因而檢測需扣除“溶劑空白”，既麻煩又易引入誤差。如果解決了水不溶性藥物及待測組分在水

5、中的溶解分散問題，水這一理想的頂空溶劑會在很多藥物的揮發(fā)性的分析檢測中得到應用。
　　 本文采用以水為頂空溶劑加入少量改性劑-甲醇的方法，建立了分析檢測百草油中薄荷腦和水楊酸甲酯含量的HS-GC，改性劑充分溶解藥物基質后再加入水中能使藥物迅速分散在水中，同時甲醇在頂空溶劑中所占比例很少，進入色譜柱的量相對較小，而且甲醇保留時間也較短，不干擾測定，適用于羅浮山百草油的質量控制。在水中加入少量改性劑的方法雖然解決了待測組分的溶解分散

6、問題，但仍存在的缺點是少量的改性劑-甲醇易揮發(fā)略影響待測組分的頂空效率，通過綜合考慮頂空溶劑對藥物及待測成分的溶解性及頂空效率，我們建立了以0.1％的聚山梨酯80水溶液為頂空溶劑的HS-GC分析檢測萘敏維滴眼液中薄荷醇含量的方法，表面活性劑-聚山梨酯80的加入，既增大薄荷醇在水中的溶解度，又保證了較高的頂空效率，靈敏度高，而且聚山梨酯80不揮發(fā)，不干擾檢測，0.1％的聚山梨酯80水溶液有望成為分析檢測脂溶性藥物及待測揮發(fā)性成分的理想頂空

7、溶劑。
　　 近年來，離子液體作為一種新型溶劑，憑借其非揮發(fā)性和高溶解性的特點已成為頂空溶劑的研究熱點，本課題組己在以往的研究中采用多種離子液體作為頂空溶劑的HS-GC分析檢測了藥物中的有機溶劑殘留，但目前離子液體的種類繁多，致使人們在應用時面對龐大的離子液體家族無從選擇，主要停留在“嘗試-比較-篩選”的階段，這不僅會造成時間、精力及成本的浪費，而且不能達到最佳的理想效果。但離子液體在HS-GC的理論研究缺乏，特別是其對某些有機

8、溶劑的頂空分配行為的研究方面缺少理論指導，因此本文研究了三種離子液體作為頂空溶劑對八種醇類有機溶劑的分配行為，初步建立了頂空分配系數(shù)與溶劑的物理性質相互關聯(lián)的數(shù)學模型，為以后HS-GC分析檢測有機溶劑時選擇合適的離子液體提高方法的靈敏度提供了理論基礎。該方法可以擴展到更多的離子液體和有機溶劑，通過進一步優(yōu)化模型的參數(shù)，逐漸揭示離子液體對待測溶劑的頂空分配規(guī)律，以此指導正確合理的選用離子液體。該部分研究正在進行中。
　　 通過對傳

9、統(tǒng)溶劑水的改性行為的研究，解決了待測藥物及組分的溶解分散問題，又保證了頂空效率，建立了HS-GC分析檢測藥物中各種揮發(fā)性成分含量的方法，避免了傳統(tǒng)方法的諸多不足，但仍存在一些缺點，如待測組分僅通過與頂空溶劑分配后即進樣檢測，限制了靈敏度的提高。為進一步提高方法的靈敏度，我們嘗試建立頂空單滴微萃取(HS-SDME)的方法分析檢測藥物中的揮發(fā)性成分，這樣待測組分經(jīng)過二次分配與富集，靈敏度更高，更適合分析檢測成分復雜的藥物中的揮發(fā)性成分。該法

10、集揮發(fā)性成分的分離、純化與富集為一體，既可以減少干擾成分，又避免了對后續(xù)色譜檢測系統(tǒng)的污染，是簡便、快速和靈敏的樣品前處理新技術。
　　 因此本文在已建立了分析檢測百草油中薄荷腦和水楊酸甲酯含量的HS-GC的基礎上，仍通過考察優(yōu)化HS-SDME的萃取條件，建立了以DMF為萃取溶液的HS-SDME-GC分析測定了百草油中的二主成分的含量，該法避免了傳統(tǒng)方法的諸多不足，操作簡單，分析成本低，在密閉容器中僅5min即完成了萃取純化過程

11、，分析速度快，且靈敏度更高。
　　 HS-SDME雖然優(yōu)點多但也存在一些缺點，例如萃取的溶劑多為有機溶劑，萃取液滴體積小，易揮發(fā)，不易高溫萃取且萃取維持時間短等。因此本文充分利用離子液體的非揮發(fā)性、溶解性能高、較大的黏度和密度等特性特性，設計了離子液體-單滴微萃取技術應用于藥物中的高沸點的揮發(fā)性成分的分析測定，并對單滴的懸滴裝置的改進，增大了液滴的體積，從而提高了液滴的穩(wěn)定性和方法的靈敏度，使得改進的方法可用于可在高溫下大液滴長

12、時間萃取分析藥物中的高沸點揮發(fā)性成分，最終采用此法分析測定了復方鮮竹瀝液中愈創(chuàng)木酚的含量及復方甘草片中樟腦和反式茴香腦的含量，避免了傳統(tǒng)萃取方法的缺點，直接進樣HPLC分析測定，操作簡單快速，結果準確，環(huán)境友好。
　　 綜上研究，本文建立的藥物中揮發(fā)性成分的分析檢測的新的樣品前處理方法，彌補以往樣品前處理的不足，為藥物中揮發(fā)性成分的質量控制提供簡便、快速、靈敏的前處理手段。
　　 第一部分、傳統(tǒng)頂空溶劑HS-GC在藥物中

13、揮發(fā)性成分的分析研究與應用
　　 一、水為頂空溶劑HS-GC測定藿香正氣口服液著乙醇殘留量
　　 目的：解決直接進樣對色譜系統(tǒng)的污染及對待測物的干擾問題，建立HS-GC測定藿香正氣口服液中殘留溶劑乙醇的含量。
　　 方法：以水為頂空溶劑，在80℃的頂空溫度下頂空平衡25min，抽取上部頂部氣體0.5mL進樣測定。采用DM-WAX毛細管柱(30m×0.32mm×0.25μm），柱溫：70℃；進樣口溫度：150℃；F

14、ID檢測器，溫度：200℃。
　　 結果：該法避免了直接進樣的諸多不足，線性范圍寬、回收率好、靈敏度高。方法驗證表明被測溶劑乙醇在1.95～5.00×102μg·mL-1的范圍內(nèi)線性關系良好(r=0.9999)，平均回收率為96.5％(RSD=1.5％)，檢測限達0.122μg·mL-1。
　　 結論：該方法簡單、準確、靈敏，以水作為項空溶劑，避免了其他高沸點的頂空溶劑如DMF、DMSO等在頂空時揮發(fā)產(chǎn)生極大的溶劑峰干擾

15、待測組分的測定，又不污染色譜系統(tǒng)，適用于藿香正氣口服液中乙醇殘留的含量測定。
　　 二、加改性劑的水為頂空溶劑的HS-GC測定羅浮山百草油中薄荷腦和水楊酸甲酯的含量
　　 目的：通過加入改性劑的方法，解決脂溶性藥物百草油及揮發(fā)性成分百草油和水楊酸甲酯的溶解問題，建立一種簡單快速的HS-GC測定羅浮山百草油中薄荷腦和水楊酸甲酯含量。
　　 方法：將樣品的甲醇溶液50μL直接注入2mL水中頂空分析，在80℃的頂空溫度

16、下頂空平衡30min，抽取上部頂部氣體1.0mL進樣測定。采用SMA-WAX（30m×0.53mm×0.50μm）的毛細管柱，聚乙二醇為固定液，程序升溫，起始溫度100℃保持3min，4℃/min升到112℃，再以10℃/min到152℃，保持5min;進樣口溫度：200℃；FID檢測器溫度：230℃。
　　 結果：該法避免了復雜的樣品前處理，薄荷腦、水楊酸甲酯和其他成分的分離度良好，其加樣回收率分別為99.2％和98.1％，R

17、SD分別為0.5％和0.9％。薄荷腦和水楊酸甲酯分別在62.4～9.98×102μg·mL-1和1.25×102～2.00×103μg·mL-1的范圍內(nèi)線性關系良好，r均大于0.9990。兩種成分的檢測限分別為1.95μg·mL-、7.81μg·mL-1。
　　 結論：該方法操作簡單快速，定量準確，改性劑-甲醇的加入既解決了樣品的溶解問題，同時其在頂空溶劑中所占分數(shù)較小，進入色譜柱的量相對較小，而且甲醇保留時間也較短，不干擾測定

18、，該法適用于羅浮山百草油的質量控制。
　　 三、加入增溶劑的水為頂空溶劑的HS-GC測定萘敏維滴眼液中薄荷醇的含量
　　 目的：采用加入增溶劑聚山梨酯80的方法，解決薄荷醇的溶解問題和提高方法的靈敏度，建立簡單快速的HS-GC分析檢測萘敏維滴眼液中的微量薄荷醇含量。
　　 方法：以0.1％聚山梨酯80溶液為頂空溶劑，在85℃頂空平衡20min，抽取頂空氣體1.0mL進樣測定。采用SMA-WAX毛細管柱(30m×0

19、.53mm×0.50μm)，固定液聚乙二醇；柱溫125℃；進樣口溫度150℃；FID檢測器溫度170℃。
　　 結果：該法避免了復雜的樣品前處理，回收率和重現(xiàn)性良好、待測組分達到了高富集，方法的靈敏度高。方法驗證表明薄荷醇在2.4～76.8μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關系良好(r=0.9994)，回收率在100.4～101.1％，RSD小于1.5％，薄荷醇的檢測限達9.45μg·L-1。
　　 結論：該方法操作簡單快速，

20、定量準確，0.1％的聚山梨酯80溶液為頂空溶劑，既增大薄荷醇在水中的溶解度，又保證了較高的頂空效率，靈敏度高，可用于制劑中微量薄荷醇的質量控制。
　　 第二部分、新型頂空溶劑-離子液體HS-GC在藥物中揮發(fā)性成分-有機殘留溶劑的分配行為的理論研究
　　 定量預測離子液體-頂空空間分配系數(shù)的模型的建立
　　 目的：通過采用HS-GC研究某些有機溶劑在離子液體和頂空空間的分配行為，建立對待測溶劑具有理想頂空分配行為的

21、離子液體模型。
　　 方法：以三種常用的咪唑基離子液體為頂空溶劑分析檢測八種醇類溶劑，在100℃的頂空溫度下頂空平衡時間30min，氣體進樣0.5mL。采用ZM-1毛細管柱（60m×0.53mm×5.00μm），起始柱溫為50℃，保持2min，以5℃/min升至130℃保持2min;進樣口溫度：180℃；FID檢測器，溫度：200℃。
　　 結果：通過實驗計算得出頂空分配系數(shù)，采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0分析處理各種參數(shù)

22、的關系，建立了可用于預測離子液體-項空空間分配系數(shù)的模型，模型中引入了溶劑的物理性質參數(shù)-沸點和油水分配系數(shù)，并得到了三個回歸方程，相關系數(shù)均大于0.988。
　　 結論：該方法可以用于更多的離子液體和有機溶劑，因為分配系數(shù)與方法的靈敏度成反比，離子液體分配模型的建立對簡單快速選擇合適的離子液體作為頂空溶劑檢測有機殘留溶劑具有重要意義。
　　 第三部分、HS-SDME在藥物中揮發(fā)性成分的分析研究與應用
　　 一、

23、DMF為萃取溶劑的HS-SDME-GC快速分析百草油中揮發(fā)性成分的含量
　　 目的：進一步改善直接HS-GC的靈敏度，采用簡單、快速、靈敏的HS-SDME-GC分析測定百草油中揮發(fā)性成分薄荷醇和水楊酸甲酯含量。
　　 方法：精密吸取樣品的甲醇溶液10μL注入盛有5mL水的樣品瓶中，以1.5μLDMF為萃取溶液（含內(nèi)標苯甲醇），萃取溫度為40℃、萃取時間為5min，萃取后直接吸回0.5μL進樣GC分析檢測。采用30m×0.

24、53mmPEG毛細管柱，其他色譜條件見第一部分（二）。
　　 結果：該方法的薄荷醇、水楊酸甲酯和其他成分的分離度良好，加樣回收率在95.4％～99.2％之間，RSD均低于1.9％。薄荷醇和水楊酸甲酯分別在1.26～80.5μg·mL-1(r=0.9990)和2.48～1.59×102μg·mL-1(r=0.9991)的范圍內(nèi)線性關系良好。兩種成分的最低檢測限分別為7.86×10-2μg·mL-1、0.156μg·mL-1，較直接

25、HS-GC的靈敏度更高。
　　 結論：該方法避免了復雜的樣品前處理，操作簡單快速，僅5min即完成萃取、純化，適用于中藥及其制劑中揮發(fā)性成分的含量測定。
　　 二、新型離子液體為萃取溶劑的HS-SDME-HPLC分析測定中藥中的高沸點揮發(fā)性成分
　　 目的：充分利用離子液體的非揮發(fā)性、溶解性能高、較大的黏度和密度等特性特性，設計了離子液體HS-SDME技術應用于藥物中的高沸點的揮發(fā)性成分的分析測定，避免常用萃取有

26、機溶劑萃取液滴體積小，易揮發(fā)，不易高溫萃取且萃取維持時間短等缺點，并改進單滴的懸滴裝置，提高液滴的穩(wěn)定性和方法的靈敏度，使HS-SDME可用于高溫下大液滴長時間萃取分析藥物中的高沸點揮發(fā)性成分，并分析測定復方鮮竹瀝液中愈創(chuàng)木酚的含量。
　　 方法：通過改進懸滴裝置，增大了液滴與微量進樣器針尖處塑料套管的接觸面積，使離子液體的液滴體積達12μL，提高了液滴的穩(wěn)定性及方法的靈敏度。以12μL1-丁基-3-甲基咪唑基六氟磷酸鹽([BM

27、IM][PF6])為懸滴，在5mL含36％(w/v)NaCl的樣品液中，萃取溫度80℃、攪拌速度1000rpm的條件下，頂空萃取30min，萃取后直接將液滴吸回微量進樣器，進樣HPLC分析檢測。色譜柱：KromasilC18柱(150×4.6mm，5μm)，流動相：1％冰醋酸水溶液：甲醇（體積比70:30）；流速：1.0mL/min;檢測波長：274nm;柱溫：室溫。
　　 結果：該法避免了傳統(tǒng)方法的不足，結果準確，靈敏度高。方

28、法驗證表明愈創(chuàng)木酚在5.04×10-2～1.61μg·mL-1的范圍內(nèi)線性關系良好（r=0.9997），檢出限為0.394μg·L-1，愈創(chuàng)木酚的加樣回收率為97.6％，RSD為2.5％。
　　 結論：該方法操作簡單快速，定量準確，成本低，無污染，且避免了復雜的樣品前處理，解決了傳統(tǒng)萃取溶劑及原有萃取裝置的諸多不足，適用于分析測定藥物中的高沸點揮發(fā)性成分的含量。
　　 三、新型離子液體為萃取溶劑的HS-SDME-HPLC

29、分析測定復方甘草片中的樟腦和反式茴香腦的含量
　　 目的：充分利用離子液體的特性及改進的懸滴裝置，建立了一種離子液體HS-SDME-HPLC分析測定復方甘草片中樟腦和反式茴香腦的含量。
　　 方法：通過改進懸滴裝置，增大了液滴與微量進樣器針尖處塑料套管的接觸面積，使離子液體的液滴體積達12μL，提高了液滴的穩(wěn)定性及方法的靈敏度。通過系統(tǒng)考察影響離子液體頂空單滴微萃取的因素（離子液體類型，液滴體積，轉速，離子強度，萃取溫度

30、和萃取時間），確立了最佳的萃取條件后進樣HPLC分析檢測。液相色譜條件為色譜柱：PromosilC18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動相：甲醇：水（體積比70:30）；流速：1.0mL/min;檢測波長：289nm;柱溫：35℃。
　　 結果：樟腦和反式茴香腦均在0.156～10.0μg·mL-1的范圍內(nèi)線性關系良好(r=0.9990，0.9998)，樟腦和反式茴香腦的回收率為98.5～101.2％，RSD均低于4.2