動(dòng)脈粥樣硬化過程中D-dimer和Nogo-B對巨噬細(xì)胞功能的影響.pdf

1、研究背景：動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種慢性的炎癥反應(yīng)，單核巨噬細(xì)胞在該病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用：AS初期，單核細(xì)胞粘附于受損內(nèi)皮細(xì)胞表面并遷移到內(nèi)膜下分化為巨噬細(xì)胞，后者吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞；泡沫細(xì)胞通過分泌促炎因子誘導(dǎo)斑塊區(qū)的炎癥反應(yīng)進(jìn)一步發(fā)生；AS后期，泡沫細(xì)胞壞死導(dǎo)致胞外脂質(zhì)堆積形成壞死核心；而巨噬細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶也與斑塊不穩(wěn)定性相關(guān)。凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（Lectin-like

2、 oxLDL receptor-1，LOX-1）在參與AS的細(xì)胞表面均有表達(dá)：LOX-1介導(dǎo)氧化低密度脂蛋白（Oxidized Low Density Lipoprotein，oxLDL）引發(fā)的內(nèi)皮損傷及粘附分子表達(dá)，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞與內(nèi)皮的粘附，脂質(zhì)的攝取及泡沫細(xì)胞的形成。許多病理因素可通過上調(diào)LOX-1的表達(dá)參與AS的發(fā)展。D-dimer是纖維蛋白降解產(chǎn)物，目前作為一個(gè)獨(dú)立的臨床指標(biāo)用于疚病的診斷。血漿D-dimer水平可以指示AS

3、的嚴(yán)重程度。基因芯片結(jié)果顯示，D-dimer可上調(diào)巨噬細(xì)胞LOX-1表達(dá)，提示D-dimer可能參與AS。Nogo-B蛋白在血管重構(gòu)過程中發(fā)揮引人注目的作用，也有研究表明該蛋白與AS相關(guān)。
　　 目的：研究D-dimer對巨噬細(xì)胞oxLDL受體LOX-1的表達(dá)，巨噬源性泡沫細(xì)胞的形成及其功能的影響。Nogo-B在巨噬源性泡沫細(xì)胞中的表達(dá)變化及其對泡沫細(xì)胞功能的影響。
　　 方法和結(jié)果：
　　 1.用D-dimer

4、處理RAW264.7細(xì)胞，收集不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞提取總RNA及總蛋白，分別用Realtime PCR和Western blot方法測定樣品中LOX-1 mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示D-dimer對LOX-1的誘導(dǎo)作用呈時(shí)間依賴性，刺激12h后mRNA表達(dá)即上調(diào)，最大效應(yīng)出現(xiàn)在24～36h，48h以后誘導(dǎo)作用減弱。LOX-1蛋白的表達(dá)則在24～48h最為明顯。用不同濃度D-dimer與RAW264.7細(xì)胞共孵育，再測定LOX-1 mRNA和

5、蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示D-dimer對LOX-1的誘導(dǎo)作用呈劑量依賴性，1μg/mL D-dimer即可誘導(dǎo)LOX-1的表達(dá)
　　 2.分別用D-dimer（2μg/mL），oxLDL（10μg/mL）與巨噬細(xì)胞共孵育48小時(shí)，然后用Western blot檢測細(xì)胞中CD36的表達(dá)，結(jié)果顯示該濃度的D-dimer不能上調(diào)CD36蛋白的表達(dá)，oxLDL也不能促使CD36表達(dá)顯著升高。但將細(xì)胞先用相同濃度的D-dimer處理24h后再用

6、oxLDL（10μg/mL）孵育24h，Western blot結(jié)果顯示CD36蛋白表達(dá)較陰性對照組及oxLDL處理組均顯著升高。
　　 3.D-dimer孵育巨噬細(xì)胞24h后用LOX-1的抗體封閉細(xì)胞表面受體，再用Dil-oxLDL刺激細(xì)胞，觀察各紐細(xì)胞熒光強(qiáng)度差異。結(jié)果顯示，D-dimer處理組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與未處理組相比明顯增強(qiáng)，而用LOX-1抗體處理細(xì)胞后，熒光強(qiáng)度下降。提示D-dimer可能通過誘導(dǎo)LOX-1表達(dá)促進(jìn)巨

7、噬細(xì)胞吞噬oxLDL，用oxLDL刺激預(yù)先用D-dimer處理過細(xì)胞，用Realtime PCR檢測炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)。結(jié)果顯示：D-dimer可以增強(qiáng)oxLDL對炎癥因子的誘導(dǎo)作用。
　　 4.D-dimel孵育巨噬細(xì)胞24h，Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)組成型PKC蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示D-dimer可增加該蛋白的表達(dá)。用PKC抑制劑預(yù)處理巨噬細(xì)胞，再用D-dimer孵育，Western blot檢測細(xì)胞

8、LOX-1蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明用PKC抑制劑處理后，D-dimer對LOX-1表達(dá)的誘導(dǎo)作用減弱。
　　 5.用不同濃度DiI-oxLDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，以熒光強(qiáng)度指示脂質(zhì)吞噬量。48h后將細(xì)胞裂解，Western blot檢測泡沫細(xì)胞中Nogo-B的表達(dá)。各組熒光強(qiáng)度表明巨噬細(xì)胞對脂質(zhì)的吞噬量與細(xì)胞外DiI-oxLDL濃度呈正比，Westernblot結(jié)果顯示泡沫細(xì)胞中Nogo-B蛋白表達(dá)增多，且低濃度oxL

9、DL（≤10μg/mL）不能誘導(dǎo)Nogo-B蛋白的表達(dá)。
　　 6.Nogo-B的siRNA轉(zhuǎn)染Raw264.7細(xì)胞，48h后檢測細(xì)胞中Nogo-B蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示siRNA可以有效降低巨噬細(xì)胞中Nogo-B蛋白的表達(dá)，沉默效率可達(dá)70％以上。用oxLDL刺激轉(zhuǎn)染siRNA的巨噬細(xì)胞，Realtime PCR檢測細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6的表達(dá)，結(jié)果顯示：減少Nogo-B蛋白表達(dá)可以使泡沫細(xì)胞表達(dá)更多的促炎因子